专利名称：一种定量化微生物冻干品的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物冻干品的制备方法，特别涉及一种定量化微生物冻干品的 制备方法。
背景技术：
菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作，国际上一直比 较重视微生物菌种资源的保藏与共享交流。早在19世纪末，欧洲开始有了一些管理规范 的菌种保藏机构；在20世纪初，一些著名菌种保藏机构相继成立，1904年的NRRL在美国成 立，1925年成立了 ATCC，目前ATCC已发展成为全球最大的菌种保藏供应中心。有关质控菌株的保藏在国外已有研究，其原理与一般菌种保藏相同，目前采用的 保藏方法主要有定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、-80°C冰箱冻结法、 液氮超低温冻结法等，目的是为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境，通常采取干燥、低 温、缺乏氧气和养料等方式，使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而 达到保藏的目的。这些方法普遍需要昂贵的专用仪器，设备成本高，保藏过程中的能耗也 尚ο现在国外许多专业菌种保藏中心采用冷冻干燥、超低温冻结等方法进行保藏，同 时为了与食品、药品等生产使用过程更好地接轨，对质控微生物菌种的保藏形式进行了改 进。目前市面上比较常见的有MicroBiologics公司和remel公司的产品，这些产品都比较 安全便捷，实验室操作人员可根据自己的需要选择合适的质控菌株形式，大大提高了效率。我国微生物资源库，虽然有的建立也较早，但由于资金和管理机制等问题，发展一 度缓慢，目前国家积极加大资金投入，很多领域的微生物保藏库开始发展壮大，资源品种、 数量和信息量开始加速提高，并开始实现共享。中国微生物界最大的菌种保藏组织是中国 微生物菌种保藏管理委员会，其下属各专业保藏中心目前已经联合建立了我国第一个统一 数据结构的国家级菌种保藏数据库——中国微生物菌种目录数据库。我国的专业菌种库采 用的保藏方法与国外也基本一致。迄今为止，国内菌种都采用较为单一的冻干管形式，且还没有关于含菌量一定的 菌种形式的研发。在开冻干管进行复苏的过程中，稍微不小心就可能炸裂冻干管，不仅比较 容易污染目标菌，也较容易烫伤或割伤自己，而且在操作过程中比较容易形成气溶胶，对人 的健康造成威胁。由于目前国内基层单位和大部分生产企业一般不设菌种管理专员，保藏菌种设施 也不齐全，而且微生物检验人员专业操作水平不高，因此比较容易导致质控菌株在使用过 程中出现死亡、变异、污染等问题。而且保藏菌株在使用过程中也往往需要经过复苏、转接、 稀释等繁琐的过程，这些不但耗时且耗费大量的人力、物力，且还有可能影响检验结果的准 确可靠性，严重降低了工作效率，使产品的质量得不到保证，如果因菌株问题使实验失败， 还需重新取样，延缓了产品的销售和增加企业的成本。针对这种现状，为了大大减少了企业的准备过程及保藏中所带来的设备、人力不
3足等一系列问题，并使其检验结果的准确性、质量得到有力的保证，提高了相关行业的生产 效率。因此，有必要提供一种可用于微生物菌种定量化保存的保护剂。使企业在可以根据 不同要求购买到合适的菌种后，不需特殊的保藏，直接将菌株复活后，即可得到某一浓度的 菌悬液，即买即用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定量化微生物冻干品的制备方法。本发明所采取的技术方案是
一种定量化微生物冻干品的制备方法，包括以下步骤
1)将稳定期的微生物稀释，得到均勻的稀释液，制成定量浓度的菌悬液；
2)将菌悬液与保护剂混合，得到混合液；
3)取定量混合液装瓶，-20°C以下预冻，之后真空冷冻干燥，并真空密封，得到定量化 微生物冻干品；
其中，保护剂含有0. 1 10质量份的水溶性糖、0. 1 5质量份的脱脂奶粉、0. 1 20 质量份的明胶、0 10质量份的活性炭。优选的，预冻的温度为-80 -30°c。优选的，保护剂含有3 5质量份的水溶性糖、0. 5 3质量份的脱脂奶粉、5 13 质量份的明胶、0. 01 4质量份的活性炭。菌悬液中微生物与保护剂的比例为IO2 IOltlCfu/每克保护剂。优选的，水溶性糖为葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖中的至少一种。本发明方法制备得到的微生物冻干品，含有基本定量的微生物，使用方便；本发明 方法制备得到的微生物冻干品，无需低温冷藏，只要保存在8°C以下即可保证其内的微生物 活性，保存在其中的微生物的生化特性在保存期内基本没有变化。使用本发明保护剂保护 的微生物菌种冻干品，可以在20°C的环境下稳定存活超过30天，对外界环境要求不高，大 大方便了接种等操作。使用本发明的方法制备得到的微生物冻干品，可基本保证冻干品的 微生物量在一个数量级内，如1 10X103cfu/ml内。
图1是金黄色葡萄球菌ATCC6538在4°C保存下菌落数随时间变化趋势图。图2是金黄色葡萄球菌ATCC6538在20°C保存下菌落数随时间变化趋势图。图3是不同菌在4°C保存下菌落数随时间变化趋势图。图4是不同菌在20°C保存下菌落数随时间变化趋势图。图5是金黄色葡萄球菌冻干前和使用本发明保护剂冻干后复苏在Baird -Parker 琼脂上的菌落图。图6是金黄色葡萄球菌冻干前和使用本发明保护剂冻干后复苏在甘露醇盐琼脂 上的菌落图。
具体实施例方式一种定量化微生物冻干品的制备方法，包括以下步骤1)将稳定期的微生物稀释，得到均勻的稀释液，制成定量浓度的菌悬液；
2)将菌悬液与保护剂混合，得到混合液；
3)取定量混合液装瓶，-20°C以下预冻，之后真空冷冻干燥，并真空密封，得到定量化 微生物冻干品；
其中，保护剂含有0. 1 10质量份的水溶性糖、0. 1 5质量份的脱脂奶粉、0. 1 20 质量份的明胶、0 10质量份的活性炭。优选的，预冻的温度为-80 -20°C。优选的，保护剂含有3 5质量份的水溶性糖、0. 5 3质量份的脱脂奶粉、5 13 质量份的明胶、0. 01 4质量份的活性炭。水溶性糖为常见的单糖、二糖等对微生物活性无抑制作用的糖，如葡萄糖、果糖、 蔗糖、乳糖。菌悬液中微生物与保护剂的比例为IO2 IOltlCfu/每克保护剂。在冻干保存前，先将菌株复苏传代，将单一菌株在本领域技术人员所熟知的条件 下培养至稳定期，即产芽孢的细菌培养至芽孢从菌体脱落或产孢子的放线菌、霉菌至孢子 丰 两ο以下实施例中使用的微生物，全部为公众可以获得的常规模式菌种，其作用仅在 于证明本发明方法的优越性，并不是本发明技术方案的一部分。显然，本领域的技术人员也 可以使用其他的菌种来验证本发明的技术方案。实施例1
一种定量化微生物冻干品的制备方法，包括以下步骤
1)将稳定期的标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC6538用0.85%的灭菌生理盐水稀释，用 振荡器振荡得到均勻的稀释液，制成定量浓度的菌悬液；
2)取定量菌悬液与保护剂按IO8Cfu/每克保护剂的比例混合，得到混合液；
3)取定量混合液装瓶，-30°C预冻，之后真空冷冻干燥，并真空密封，得到定量化微生 物冻干品；
其中，保护剂由0. 1质量份的葡萄糖、4质量份的脱脂奶粉、20质量份的明胶组成。对比例1
使用10%的脱脂奶粉作为保护剂，按同样的方法制备得到定量化微生物冻干品。实施例2
一种定量化微生物冻干品的制备方法，包括以下步骤
1)将稳定期的大肠埃希菌CMCC(B) 44102用0. 85%的灭菌生理盐水稀释，用振荡器 振荡得到均勻的稀释液，制成定量浓度的菌悬液；
2)取定量菌悬液与保护剂按IO6Cfu/每克保护剂的比例混合，得到混合液；
3)取定量混合液装瓶，-40°C预冻，之后真空冷冻干燥，并真空密封，得到定量化微生 物冻干品；
其中，保护剂由3质量份的葡萄糖、3质量份的脱脂奶粉、8质量份的明胶、0. 01质量份 的活性炭组成。实施例3
一种定量化微生物冻干品的制备方法，包括以下步骤
51)将稳定期的金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003用pH=7. 2的PBS稀释，用振荡器振荡 得到均勻的稀释液，制成定量浓度的菌悬液；
2)取定量菌悬液与保护剂按IO7Cfu/每克保护剂的比例混合，得到混合液；
3)取定量混合液装瓶，-50°C预冻，之后真空冷冻干燥，并真空密封，得到定量化微生 物冻干品；
其中，保护剂由5质量份的果糖、0.5质量份的脱脂奶粉、5质量份的明胶、4质量份的活 性炭组成。按同样的方法制备得到革兰阴性杆菌大肠埃希菌CMCC (B) 44102、乙副伤寒沙 门菌CMCC (B) 50094 ；革兰阳性不产芽胞杆菌单核细胞增生李斯特菌ATCC19115 ；革兰阳 性产芽胞杆菌枯草芽胞杆菌CMCC (B) 63501 ；厌氧菌生孢梭菌CMCC (B) 64941 ；革兰阳 性球菌粪肠球菌ATC(^9212 ；真菌黑曲霉CMCC (B) 98003的冻干品。实施例4
一种定量化微生物冻干品的制备方法，包括以下步骤
1)将稳定期的粪肠球菌ATC(^9212用0. 85%的灭菌生理盐水稀释，用振荡器振荡得 到均勻的稀释液，制成定量浓度的菌悬液；
2)取定量菌悬液与保护剂按IO4Cfu/每克保护剂的比例混合，得到混合液；
3)取定量混合液装瓶，_35°C预冻，之后真空冷冻干燥，并真空密封，得到定量化微生 物冻干品；
其中，保护剂由2质量份的果糖、2质量份的乳糖、1. 5质量份的脱脂奶粉、13质量份的 明胶、2质量份的活性炭组成。实施例5
一种定量化微生物冻干品的制备方法，包括以下步骤
1)将稳定期的黑曲霉CMCC(B) 98003用0. 85%的灭菌生理盐水稀释，用振荡器振荡 得到均勻的稀释液，制成定量浓度的菌悬液；
2)取定量菌悬液与保护剂按IO5Cfu/每克保护剂的比例混合，得到混合液；
3)取定量混合液装瓶，-80°C预冻，之后真空冷冻干燥，并真空密封，得到定量化微生 物冻干品；
其中，保护剂由1质量份的蔗糖、0. 1质量份的脱脂奶粉、0. 1质量份的明胶、10质量份 的活性炭组成。实施例6
一种定量化微生物冻干品的制备方法，包括以下步骤
1)将稳定期的单核细胞增生李斯特菌ATCC19115用pH=7.2的PBS稀释，用振荡器振 荡得到均勻的稀释液，制成定量浓度的菌悬液；
2)取定量菌悬液与保护剂按IO5Cfu/每克保护剂的比例混合，得到混合液；
3)取定量混合液装瓶，-80°C预冻，之后真空冷冻干燥，并真空密封，得到定量化微生 物冻干品；
其中，保护剂由3质量份的乳糖、4质量份的葡萄糖、4. 5质量份的脱脂奶粉、17质量份 的明胶、8质量份的活性炭组成。实施例7
6一种定量化微生物冻干品的制备方法，包括以下步骤
1)将稳定期的乙副伤寒沙门菌CMCC(B)50094用pH=7. 2的PBS稀释，用振荡器振荡 得到均勻的稀释液，制成定量浓度的菌悬液；
2)取定量菌悬液与保护剂按IO6Cfu/每克保护剂的比例混合，得到混合液；
3)取定量混合液装瓶，-20°C预冻，之后真空冷冻干燥，并真空密封，得到定量化微生 物冻干品；
其中，保护剂由6质量份的果糖、4质量份的果糖、5质量份的脱脂奶粉、3质量份的明 胶、6质量份的活性炭组成。对比试验1
从实施例1的两种定量化微生物冻干品中的随机取样，4°C下避光保存，每隔1星期随 机抽取样品1瓶进行菌落总数试验，结果如图1所示。从实施例1的两种定量化微生物冻干品中的随机取样，下避光保存，每隔3或4天 随机抽取样品1瓶进行菌落总数试验，结果如图2所示。图1和图2中，■表示实施例1的 定量化微生物冻干品，▲表示对比例1的定量化微生物冻干品。由图1和图2可知，通过本发明方法制得的定量化微生物冻干品，在保存期间，微 生物的量基本不变。对比试验2
将实施例3得到的各种定量化微生物冻干品分别于4°C和20°C下避光保存，与对比试 验1类似的取样进行菌落总数试验，结果如图3和图4所示。图3是不同菌在4°C保存下菌 落数随时间变化趋势图，图4是不同菌在20°C保存下菌落数随时间变化趋势图。由图3和 图4可知，本发明方法适用于多种微生物的定量化冻干保存。取实施例3得到的定量化金黄色葡萄球菌冻干品分别复苏在在Baird -Parker琼 脂和甘露醇盐琼脂上，分别与使用购得菌种复苏在培养基上的菌落进行比较。图5是金黄 色葡萄球菌冻干前和冻干后复苏在Baird -Parker琼脂上的菌落图，图6是金黄色葡萄球 菌冻干前和冻干后复苏在甘露醇盐琼脂上的菌落图。由图5和图6可知，冻干前和复苏后菌落在培养基中的表型相同，可见本发明的保 护剂对菌种的生理生化特征基本无影响。
权利要求
1.一种定量化微生物冻干品的制备方法，包括以下步骤1)将稳定期的微生物稀释，得到均勻的稀释液，制成定量浓度的菌悬液；2)将菌悬液与保护剂混合，得到混合液；3)取定量混合液装瓶，-20°C以下预冻，之后真空冷冻干燥，并真空密封，得到定量化微 生物冻干品；其中，保护剂含有0. 1 10质量份的水溶性糖、0. 1 5质量份的脱脂奶粉、0. 1 20 质量份的明胶、0 10质量份的活性炭。
2.根据权利要求1所述的一种定量化微生物冻干品的制备方法，其特征在于预冻的 温度为-80 -20°C。
3.根据权利要求1所述的一种定量化微生物冻干品的制备方法，其特征在于保护剂 含有3 5质量份的水溶性糖、0. 5 3质量份的脱脂奶粉、5 13质量份的明胶、0. 01 4质量份的活性炭。
4.根据权利要求1或3所述的一种定量化微生物冻干品的制备方法，其特征在于水 溶性糖为葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种定量化微生物冻干品的制备方法，其特征在于菌悬液 中微生物与保护剂的比例为IO2 IOltlCfu/每克保护剂。
6.根据权利要求5所述的一种定量化微生物冻干品的制备方法，其特征在于菌悬液 中微生物与保护剂的比例为IO4 IO8Cfu/每克保护剂。
全文摘要
本发明公开了一种定量化微生物冻干品的制备方法，包括以下步骤将稳定期的微生物稀释，得到均匀的稀释液，制成定量浓度的菌悬液；将菌悬液与保护剂混合，得到混合液；取定量混合液装瓶，-30℃以下预冻，之后真空冷冻干燥，并真空密封，得到定量化微生物冻干品；其中，保护剂含有0.1～10份的水溶性糖、0.1～5份的脱脂奶粉、0.1～5份的抗氧化剂、0.1～20份的明胶、0～10份的活性炭。本发明方法制得的微生物冻干品，含有基本定量的微生物，使用方便；只要保存在8℃以下即可保证其内微生物的活性，微生物的生化特性在保存期内基本没有变化。
文档编号C12N1/00GK102140424SQ20101061490
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者何天文, 卢勉飞, 吴清平, 苏丽春, 蔡芷荷, 陈佐威 申请人:广东环凯微生物科技有限公司