一种类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶的制备方法及其抗菌应用
【技术领域】
[0001] 本发明设计属于生物工程领域，特别设及一种类志贺邻单胞菌隧菌体裂解酶 化ndolysin)及其作为杀菌活性成分在医疗卫生、食品加工、卫生制品中中的应用。
【背景技术】
[0002] 隧菌体是侵染细菌等原核细胞型微生物的病毒。主要由核酸和蛋白质组成。隧菌 体的遗传物质是核酸，蛋白质构成隧菌体的衣壳。隧菌体的结构简单、体积小，可W通过细 菌滤器，是一种严格寄生于活细胞的非细胞微生物。隧菌体通过利用宿主细菌的原料合成 自身的蛋白及核酸，在宿主细胞体内组装，裂解细胞、释放子代隧菌体。
[0003] 随着人们生活水平的日益提高，人们对洗手液的需求不再是仅仅的清洁作用，而 还需要洗手液具有杀菌、抑菌W及护肤的功效，现在市面上出现了不少的杀菌洗手液，但其 杀菌成分安全性不高，用含低毒性的洗手液清洗手后，当手直接接触食物，杀菌成分会对人 们身体造成一定的伤害，故其安全性不高，另外一些洗手液的安全性虽然高，但功能不齐 全，制备方法复杂，成本高，一般的消费者不能接受。授权公告号CN 101766543B的发明专利 一种含二氧化氯的消毒洗手液，其杀菌剂为二氧化氯。二氧化氯虽然杀菌效果好，但具有强 烈刺激性，接触后主要引起眼和呼吸道刺激，吸入高浓度可发生肺水肿，可致死。专利 CN101475879B-种杀菌护肤洗手液W对氯间二甲苯酪为杀菌剂，同样存在有刺激性和毒性 较强的缺点。为了克服化学杀菌剂的缺点，专利CN 101966134B-种杀菌护肤洗手液及其制 备方法公开了一中采用尼泊金醋作为杀菌剂的洗手液，但尼泊金醋在水中溶解度极低，产 品均一性和稳定性差。发明专利CN 102600053B中草药-无机抗菌剂复合杀菌洗手液及其制 备采用艾叶、青葛、黄琴、石恼皮、甘草的水提物为复合中草药抗菌剂，配W无机抗菌剂纳米 氧化银使用，但制作复杂，抗菌力低，为了防止腐败变质还需高压灭菌。所W，市场上非常需 要一种去污能力好，杀菌力强，安全可靠的洗手液。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种类志贺邻单胞菌隧菌体裂 解酶的制备方法及其抗菌应用，本发明提供的隧菌体裂解酶作为杀菌剂，其具有安全无毒、 水溶性好、抑菌谱广等优点。
[0005] 本发明实现目的的技术方案如下：
[0006] -种类志贺邻单胞菌隧菌体裂解酶的编码基因，其核巧酸序列为Seq ID NO. 1。
[0007] -种类志贺邻单胞菌隧菌体裂解酶，其氨基酸序列为Seq ID NO.2。
[000引类志贺邻单胞菌隧菌体裂解酶在制备制备防治细菌感染药物、医疗卫生用品、食 品加工添加剂、卫生制品中的应用。
[0009] -种含有类志贺邻单胞菌隧菌体裂解酶的编码基因的工程菌，所述原核细胞表达 载体为P犯30，所述的裂解酶基因被插入到P犯30的ΚρηΙ和化ndin酶切位点之间，所述的工 程菌为E.coli M15/pREP4/p犯30-gp2。
[0010] 而且，工程菌的培养条件为:培养溫度为37°C，所述诱导表达所用的诱导剂为异丙 基-β-D-硫代化喃半乳糖巧，诱导浓度为0.5mmol/L，诱导表达的溫度为16°C。
[0011] -种含有隧菌体裂解酶的洗手液，组分及重量百分比如下:甘油1~5%，乙酷化羊 毛脂1~3%，表面活性剂8~30%，隧菌体裂解酶0.001~0.0001%，pH调节剂0~3%，香精 0.01~0.03%，其余为去离子水。
[0012] 本发明的优点和积极效果是：
[0013] 本专利采用基因工程菌株发酵生产的隧菌体裂解酶作为杀菌剂，其具有安全无 毒、水溶性好、抑菌谱广等优点。裂解酶是在感染宿主晚期由隧菌体表达的一类肤聚糖水解 酶，该酶通过水解细菌细胞壁肤糖上糖与肤间的酷胺键或肤内氨基酸残基间的连键最终使 宿主细胞裂解。裂解酶不仅特异性作用于宿主，且作用时间短，作用谱较隧菌体广。裂解酶 具有高效、特异且不产生抗性等特点，目前在食品及医药行业已有成功应用的报道。
【附图说明】
[0014] 图1裂解酶基因即2的表达质粒的构建和鉴定；泳道1: PQE30载体BamHI酶切，泳道 2:重组质粒P犯30-gp2BamHI与Hindin双酶切验证，M:5肺DNA ladder;
[0015] 图2裂解酶Gp2诱导表达的鉴定；泳道1:未诱导化L1的总蛋白，泳道2:0.5mmol/L IPTG诱导4h后，HeLl的总蛋白，泳道3:超声后沉淀，泳道4:超声后上清，泳道5:纯化后的裂 解酶Gp2;
[0016] 图3裂解酶Gp2对铜绿假单胞菌原生质体的裂解活性；
[0017] 图4裂解酶Gp2对游离的铜绿假单胞菌的裂解活性。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术 手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发 明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背 离本发明实质和范围的前提下，对运些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改 动也属于本发明的保护范围。
[0019]实施例1
[0020] 隧菌体基因组的提取
[0021] (一)粗制隧菌体颗粒
[0022] (1)宿主菌的制备：从固体培养基上挑取类志贺邻单胞菌（Pies iomonas 化igelloides. )[i]单个菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37°C振荡培养6-化。
[0023] (2)隧菌体纯培养液的制备:挑取单个隧菌斑，接种于5mL对数期宿主菌培养液中， 37°C振荡培养4-化，而后将裂解液于1000化pm离屯、lOmin，上清液即为隧菌体纯培养液。
[0024] (3)隧菌体粗制颗粒的制备:将类志贺邻单胞菌过夜培养物转接到lOOmL液体LB培 养基中，接种量为1%，扩增培养至对数期(ODsgg约0.4)，加入5mL类志贺邻单胞菌隧菌体纯 培养液，37°C振荡培养6-化后得到隧菌体裂解液。向裂解液中加入面ase I和RNase A至终 浓度为扣g/mL，混匀后37°C静置化。而后加入化Cl至终浓度为0.1mol/L，混匀溶解后冰浴 化，12000rpm离屯、20min。将上清液转到另一离屯、管中后，加入阳G6000至终浓度为10%(w/ V)，充分振荡溶解后于4°C静置过夜，12000巧m离屯、20min，弃上清。用500μΙ TM(0.05mol/L 化is-HCl pH 7.5,0.2%MgS〇4· 7此0)溶液将沉淀重悬，并用等体积的氯仿反复抽提一次， 1200化pm离屯、10min，W除去重悬液中的阳G6000,最终得到隧菌体颗粒的粗提物。
[0025] (二)隧菌体基因组DNA的制备
[0026] (1)在纯化的隧菌体颗粒中加入DNase I和RNaseA，终浓度为化g/mL，37°C静置比， W降解残留的宿主菌的DNA或RNA;
[0027] (2)然后加入Imol/L EDTA(抑8.0)至终浓度50mmol/L，终止DNase I及RNase A活 性；
[0028] (3)加蛋白酶K至终浓度为50yg/mL，加 SDS至终浓度为0.5%，混匀，56°C1 h，消化 蛋白质；
[00巧](4)加入等体积苯酪:氯仿：异戊醇（25: 24:1)混匀，12000巧m离屯、lOmin，收集上 清；
[0030] (5)步骤4重复3次;收集上清，等体积氯仿，混匀，12000巧m，lOmin，收集上清；
[0031] (6)加入1/10体积3mol/L化Ac及2倍体积预冷的95 %乙醇，混匀，12000巧m， lOmin，沉淀 DNA;
[0032] (7)加70%乙醇（500化）于沉淀中，并将盖紧的离屯、管颠倒数次，12000巧m离屯、 5min，回收DNA。
[0033] (8)去掉上清液，除去管壁上的酒精液滴，将开口的离屯、管室溫干燥lOmin，而后用 双蒸水重悬DNA。
[0034] 实施例2
[0035] 裂解酶基因甜2的克隆、表达载体的构建
[0036] (1)根据甜2基因编码的序列设计一对特异性引物：
[0037] 即2F:5'-CGG GGTACCATG CAA CCA TCG CGA GCG TG-3'，见Seq ID NO.3;gp2R: 5'-CCC AAGCTTCTG GCG GCG GTG GAT TTT TG-3'，见Seq ID N0.4; W隧菌体基因组DNA为 模板用上述引物扩增甜2基因，1%琼脂糖电泳，鉴定扩增片段的大小。
[