0038] (2)将PCR产物直接用限制性内切酶ΚρηΙ和化ndin进行双酶切，37°C水浴化，1% 琼脂糖电泳，胶回收试剂盒将片段纯化回收，并将片段与之前用ΚρηΙ和化ndin双酶切且纯 化的PQE30载体于16°C连接过夜，次日转化大肠杆菌M15/PREP4感受态。将转化的混合物加 入适量的LB培养基，37°C解育20min。之后将混合物涂布于含有氨节青霉素（100μg/ml)和卡 那霉素(2化g/ml)的LB平板，37°C培养过夜；
[0039] (3)阳性克隆菌的鉴定挑取阳性克隆菌接种于含卡那霉素（2化g/mU和氨节青霉 素（lOOyg/mL)的LB液体培养基中，37°C培养过夜后，碱裂法提取质粒，用Κρη巧日BamHI进行 酶切鉴定，同时用BamHI单酶切的PQE30空质粒作为对照。将鉴定正确的质粒命名为PQE30- 甜2，含有阳性重组质粒的菌命名为化L1。
[0040] 结果如图1所示，重组质粒P犯30-gp2用BamHI进行酶切后，分别在3.化b和0.8kb处 出现祀T28a( + )载体带和gp2基因带，大小与预期相符，表明构建正确。
[0041 ] 实施例3
[0042] 裂解酶甜2蛋白的诱导表达及纯化
[0043] 将含有重组质粒的菌化L1接种到含氨节青霉素（lOOyg/mL)和卡那霉素(2扣g/血） 的LB培养液中，37°C振荡过夜培养;次日，按1:100比例转接至lOOmL LB培养基中，37°C振荡 培养至〇〇6日日值约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，16°C诱导16h。收集菌体，超声波破 碎细胞，4°C，10000巧m/min离屯、lOmin，收集上清，并将上清经0.22皿滤膜过滤，SDS-PAGE分 析裂解上清中的蛋白表达情况。将过滤的裂解上清用化S亲和层析儀柱(GE Healthcare, Sweden)纯化，具体按试剂盒说明步骤进行，获得蛋白命名为裂解酶Gp2。
[0044] SDS-PAGE分析结果如图2所示，含有重组质粒的工程菌化L1经IPTG诱导后，其上清 中在约18kD的位置有诱导蛋白条带，与预期大小相符，从而表明，重组菌化L1构建正确，且 表达的裂解酶蛋白产物Gp2为可溶性蛋白。
[0045] 实施例4
[0046] 裂解酶Gp2裂解铜绿假单胞菌原生质体
[0047] (1)铜绿假单胞菌原生质体的制备
[004引过夜培养的铜绿假单胞菌PAK转接到250mL LB培养基中，培养至00600 = 0.6,培养 物4°C，4000 X g，离屯、15min，收集菌体。菌体被氯仿饱和的0.05mol/L化is缓冲液重悬，室 溫下轻柔振荡45minD4000 Xg，4°C，离屯、15min，弃上清收集原生质体。原生质体用lOmmol/L 的憐酸盐缓冲液洗涂并重悬，最终将原生质体重悬至0D6G() = 0.6-1.0。
[0049] (2)原生质体的裂解
[0050] 终浓度为化g/mL的裂解酶与原生质体混合加入到细胞培养板中，在室溫条件下， 使用全波长酶标仪测定每个样品中的吸光度OD600 ,并使用lOmmol/L憐酸盐缓冲液作对照。 吸光度OD600下降速率比阴性对照快，说明原生质体被裂解。
[0051] 结果:裂解酶Gp2可W在化g/ml的浓度条件下高效降解铜绿假单胞菌PAK的原生质 体，当反应进行化左右时，50 %的PAK的原生质体被降解。
[0化2] 实施例5
[0053] 裂解酶Gp2裂解游离的铜绿假单胞菌细胞
[0054] 过夜培养的铜绿假单胞菌PAK转接到250mL LB培养基中，培养至006()() = 0.6,4000 X g，离屯、15min，收集菌体。菌体被lOmmol/L的憐酸盐缓冲液洗涂并重悬，最终将原生质体 重悬至0〇6〇〇 = 0.6-1.0。终浓度为化g/mL的裂解酶与游离的PAK细胞在细胞培养板中混合， 在室溫条件下，使用全波长酶标仪测定每个样品中的吸光度OD600 ,并使用lOmmol/L憐酸盐 缓冲液作对照。吸光度OD600下降速率比阴性对照快，说明游离细胞被裂解。
[0055] 结果:裂解酶Gp2可W在化g/ml的浓度条件下高效降解铜绿假单胞菌PAK，当反应 进行化左右时，50%的PAK的原生质体被降解。
[0056] 实施例6
[0057]裂解酶Gp2作为洗手液的活性成分的杀菌活性 [005引按洗手液重量百分比计各组分含量： 甘油 3% (w/w) 乙醜化羊毛腊 1% (w/w) 月桂醜胺丙基甜菜碱 巧％ (w/w) 十二綜基硫酸納 15% (w/w)
[0化9] 香精 0.01% (.w/w) 裂解酶 0.001% (w/w) 碳酸納 0.1% (w/w) 去离子氷 加至10.0% Cw./w)
[0060] 向去离子水中加入甘油、乙酷化羊毛脂、月桂酷胺丙基甜菜碱，加热至55~60°C， 揽拌均匀，冷却至室溫，用巧樣酸调抑至8~9,然后添加生物杀菌剂隧菌体裂解酶、香精，揽 拌，脱气，分装。
[0061] 表1生物杀菌洗手液(1%稀释液)1小时杀菌效果
[0062]
[0063] ~除了实施例6W外，本发明还提供W
下洗手液配方，配方中含有隧菌体裂解酶，对~ 革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均有杀灭作用；各组分的质量百分比为:甘油1~5%，乙酷化 羊毛脂1~3%，表面活性剂8~30%，隧菌体裂解酶0.001~0.0001%，pH调节剂0~3%，香 精0.01~0.03 %，其余为去离子水;所述表面活性剂为十二烷基硫酸钢、十二烷基肌氨酸 钢、十二烷基硫酸锭、脂肪醇聚氧乙締酸硫酸钢、脂肪醇聚氧乙締酸硫酸锭、挪油酷胺丙基 二甲胺乙内醋、月桂酷胺丙基甜菜碱、挪油酷胺丙基氧化胺、Triton X-100、吐溫80、吐溫 20、十四烷基Ξ甲基氯化锭、十烷基Ξ甲基漠化锭中的一种或几种混合。
[0064] 所述的杀菌洗手液的制备方法为：向去离子水中加入甘油、乙酷化羊毛脂、表面活 性剂，加热至55~60°C，揽拌均匀并溶解，冷却至室溫，用P的周节剂氨氧化钢或碳酸钢调pH 至8~9,然后添加生物杀菌剂隧菌体裂解酶、香精，揽拌，脱气，分装。
[0065] W上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征。本行业的技术人员应该了解，本 发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不 脱离本发明的精神和范围前提下，本发明还会有各种变化和改进，运些变化和改进落入要 求保护的本发明范围内。
【主权项】
1. 一种类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列为Seq ID Ν0·1〇2. -种类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶，其特征在于:其氨基酸序列为Seq ID NO.2。3. 权利要求2所述的类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶在制备制备防治细菌感染药物、医 疗卫生用品、食品加工添加剂、卫生制品中的应用。4. 一种含有如权利要求1所述的类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶的编码基因的工程菌， 其特征在于:所述原核细胞表达载体为PQE30,所述的裂解酶基因被插入到pQE30的ΚρηΙ和 HindiΠ 酶切位点之间，所述的工程菌为Ε · coli Ml5/pREP4/pQE30-gp2。5. 根据权利要求4所述的的工程菌，其特征在于:工程菌的培养条件为:培养温度为37 °C，所述诱导表达所用的诱导剂为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，诱导浓度为0.5mmol/L， 诱导表达的温度为16°C。6. -种含有如权利要求2所述的噬菌体裂解酶的洗手液，其特征在于:组分及重量百分 比如下：甘油1~5%，乙酰化羊毛脂1~3%，表面活性剂8~30%，噬菌体裂解酶0.001~ 0.0001%，pH调节剂0~3%，香精0.01~0.03%，其余为去离子水。
【专利摘要】本发明涉及一种类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶的制备方法及其抗菌应用，其氨基酸序列为Seq？ID？NO.2，其能够制备抑制细菌污染或过度生长的药物，类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶作为杀菌剂来应用。该酶通过水解细菌细胞壁肽糖上糖与肽间的酰胺键或肽内氨基酸残基间的连键最终使宿主细胞裂解。裂解酶不仅特异性作用于宿主，且作用时间短，作用谱较噬菌体广。裂解酶具有高效、特异且不产生抗性等特点，目前在食品及医药行业已有成功应用的报道。
【IPC分类】C12N1/21, C12N15/60, C12N9/88, A61Q19/10, C12R1/19, A61K8/66
【公开号】CN105543258
【申请号】CN201610016576
【发明人】杨洪江, 何洋, 荆兆元
【申请人】天津科技大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月12日