一种酯酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明克隆表达了一种醋酶，并公开了其核巧酸序列和氨基酸序列及酶学性质和 应用，属于工业微生物领域。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸醋酶(Feruloyl esterases，FAEs)又称肉桂酸醋酶，它是一种簇酸醋酶，是 能水解阿魏酸甲醋、低聚糖醋酶和多糖阿魏酸醋中的醋键，释放游离阿魏酸的酶。它能切断 细胞壁中多糖-多糖、多糖-木质素间的交联，有利于细胞壁物质中多糖的降解和木质素的 释放，因此在食品、饲料和造纸工业具有广阔的应用前景。在食品工业中，利用醋酶来降解 植物细胞壁中的阿魏酸醋键，可W得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸。而植物性原 材料通过醋酶的处理细胞壁变得疏松，作为饲料工业的原料更容易被禽畜消化利用，作为 制浆造纸工业的原料可W减少制浆工序化化学药品的使用，减少污染，并有利于后续工序 的进行。
[0003] 1987年，阿魏酸醋酶在Str邱tomyces olivoc虹omogenes中被第一次发现。研究表 明真菌、细菌、酵母都能分泌醋酶，目前发现的产酶微生物有黑曲霉（Aaspergillus niger)，链霉菌（Streptomyces avermitilis)，梭菌（Clostridium thermocellum)，乳酉《杆 菌(Xactobacilli sp.)，假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)等，但绝大多数醋酶是从真 菌中分离出来。研究发现约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)有较强的阿酸醋酶活性， 并且已经从中克隆表达出2个阿魏酸醋酶的基因 （Biochemical Properties of Two Cinn曰moyl Esterases Purified from 曰 L曰ctob曰cillus johnsonii Str曰in Isol曰ted from Stool Samples of Diabetes-Resistant Rats,Applied and environmental microbiology,2009,75(15) ,5018-5024)。通过对约氏乳杆菌的特性研究，该菌可能还有其 它的醋酶。本专利公开了一种新型的约氏乳杆菌醋酶。
【发明内容】
[0004] 本发明从约氏乳杆菌中克隆得到了一个新型的醋酶基因，利用大肠杆菌工程菌异 源表达，公开了其相关的酶学特性。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 1、菌株
[0007] 本发明醋酶基因的来源菌株为：Lactobacillus johnsonii ATCC11506(从美国 ATCC菌种库购买）。
[000引 2、醋酶基因的克隆
[0009] 提取Lactobacillus johnsonii ATCC11506菌体基因组总DNA。设计特异性引物， 应用PCR方法，扩增出醋酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。
[0010] 3、醋酶表达与纯化
[0011] 将重组质粒导入化21大肠杆菌中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，再纯化后冷 冻干燥备用。
[0012] 4、醋酶酶学性质
[0013] W阿魏酸甲醋为底物研究pH对本发明所述醋酶酶活的影响。
[0014] W阿魏酸甲醋为底物研究溫度对本发明所述醋酶酶活的影响。
[001 引 W 阿魏酸甲醋为底物测定了 Fe2\Ag+Je3\K\Ca2\Cu2+、Mg 2\Mn2\Zn2+、Ba2+离子 对酶活的影响。
[0016]醋酶的底物特性分析:所用的底物有己酸乙醋、葵酸乙醋、下酸乙醋、辛酸乙醋、乙 酸乙醋、乙締葵酸醋、己豆酸乙締醋、月桂酸乙締醋、Ξ甲基乙酸乙締醋、苯甲酸乙締醋、甲 基丙締酸乙締醋、丙酸乙締醋、正下酸乙締醋、乙酸乙締醋、甘油Ξ下醋、丫-戊内醋、乙酸下 醋、Ξ-0-乙酷基-D葡萄締糖、Ξ乙酸甘油醋、a-D( + )五乙酷葡萄糖、乙酸香叶醋、乙酸正丙 醋、乙酸异丙締醋、乳酸甲醋、二氨莱莉酬酸甲醋、辛酸甲醋、己酸甲醋、2-漠丙酸甲醋、漠乙 酸甲醋、甲基(R)-(-)-扁桃酸、漠苯乙酸甲醋、肉桂酸卞醋、乙酸-2-糞醋、丙酸糞醋、乙酸苯 醋、下酸糞基醋、4-硝基苯基辛酸醋、乙酸-1-糞醋、2,6-二径基-4-甲基苯甲酸甲醋、糞酪丙 酸醋、甲基扁桃酸醋、阿魏酸乙醋、阿魏酸甲醋、绿原酸、迷迭香酸、咖啡酸乙醋、咖啡酸苯乙 醋、对径基肉桂酸甲醋。
[0017] 酶活测定方法为:4ml反应体系，包含3ml憐酸缓冲液(0.02mol · ，抑6.0)，lml 底物溶液(4mg/ml底物），加 g冷冻干燥的酶，35°C反应4h，高溫100°C加热终止反应。用高效 液相色谱检测底物减少量，高效液相色谱检测条件为:〇-15min 10%乙腊，90%水(0.1 %甲 酸）；15-20min 100%乙腊，0水；20-30min 10%乙腊，90%水（0.1%甲酸），检测器为 Alltech 3300型蒸发光散射检测器。溫度、pH、离子、底物的影响均采用该体系。
[0018] 5. W去淀粉教皮为原料，添加该醋酶后的阿魏酸释放率分析。
[0019]去淀粉教皮按照文献的方法制备（Xylan-hydrolysing enzymes from Streptomyces spp.Enzyme and Microbial Technology, 1988,10(7):403-409.)。教皮中 阿魏酸的总量W碱法提取得到的阿魏酸计算（Preparation of ferulic acid from agricultural wastes: Its improved extraction and purification. Journal of Ag;ricul1:ural and Food 化emistry，2008,56(17) :7644-7648.)。阿魏酸释放率为阿魏酸 的酶解释放量占碱提取的阿魏酸总量的百分率
【具体实施方式】
[0020] 实施例1
[0021] 本实施例为本发明所述醋酶基因的克隆与表达。
[0022] 1'Lactobacillus johnsonii ATCC1150抓NA的提取
[0023] 将Lactobacillus johnsonii ATCC11506菌株在LB培养基中培养 12小时，12000r/ min离屯、10分钟得到菌体，应用细菌基因组DM抽提试剂盒(TaKaRa公司）按照其操作提取 Lactobacillus johnsonii ATCC11506菌体基因组总DNA，放冰箱备用。
[0024] 2、大肠杆菌感受态制备
[0025] (1)接种E.coli D册α和化21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37 °C、200巧m/min培养过夜。
[0026] (2)按1%接种量接种于50mL LB培养基中，37°C培养至0D600约0.6(约2~化）。
[0027] (3)将菌液转移到50mL预冷的离屯、管中，冰上放置30min，8000;rpm/min、4°C离屯、 5min。
[0028] (4)弃上清，加入5mL预冷的O.lmol/L CaC12溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min， 8000巧 m/min、4°C 离屯、5min。重复 2次。
[