专利名称：一种cd106阳性细胞、其鉴定、制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞的分离和制备，专利涉及一种具有更强免疫抑制能力的 CD106间充质干细胞的分离制备办法。
背景技术：
大量的体内、体外研究表明，间充质干细胞(mesenchymal stemcell, MSC)能够直接抑制T细胞的增殖、分化及其效应机制，或者通过抑制树突细胞(dendritic cell，DC)的分化和成熟，间接抑制T细胞的增殖，以及影响效应T细胞亚群的分化。除了 T淋巴细胞和 DC，MSC的靶细胞还包括众多其他类型的免疫细胞，如NK细胞(natural killer cell, NK)、 B细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等，调节这些细胞免疫生物学活性，如细胞因子的分泌，细胞毒活性等，最终诱导抗炎效应和/或免疫耐受状态。目前对MSC的免疫调节机制还不完全清楚，但是普遍认为MSC主要通过细胞间接触和可溶性因子的分泌发挥免疫抑制功能。
多种可溶性因子参与MSC介导的免疫调节效应，它们可能直接来源于MSC，或者通过MSC和靶细胞交互作用旁分泌产生。目前研究较多的可溶性因子是前列腺素E2 (PGE2) 和人吲哚胺2，3-双加氧酶(ID0)。MSC组成性表达一种对PGE2合成起关键作用的酶，即环氧化酶2 (Cyclooxygenase，COX-2)。MSC和外周血单个核细胞(PBMC)共培养可引起PGE2 的分泌上调，炎性细胞因子干扰素-Y (IFN- y )和肿瘤坏死因子-a (TNF- a )能提高MSC 释放PGE2的水平。从受体支气管肺泡灌洗液中分离的同种异源MSC具有合成PGE2的能力， 体内外可以利用化学抑制剂阻断PGE2的生成来减轻MSC介导的免疫抑制功能，这些结果表明PGE2是参与MSC免疫调节效应的关键分子。MSC不组成性表达ID0，但是靶细胞来源的 IFN-Y可诱导MSC表达IDO。IDO是色氨酸降解为犬尿氨酸过程中的限速酶，而色氨酸是 T细胞增殖所必需的氨基酸，其降解产物的堆积对T细胞增殖有抑制作用，这样，在IFN-Y 存在下，MSC表达ID0，加速色氨酸的代谢，抑制T淋巴细胞的增殖。其他参与MSC免疫调节的可溶性因子包括转化生长因子-P I (TGF-^ I)、肝细胞生长因子(HGF)、白细胞介素-10 (IL-10)、白细胞介素-6 (IL-6)、可溶性组织相容性白细胞抗原-G5 (HLA-G5)、一氧化氮 (NO)和半乳糖凝集素-9 (Galectin-I)等,它们可能通过诱导调节性T细胞的生成、影响效应靶细胞的增殖、凋亡以及效应因子的分泌等途径介导MSC的免疫抑制功能。NO则更多参与小鼠MSC介导的免疫抑制效应。
多种因素影响MSC的免疫调节能力，其中最重要的因素可能是细胞因子微环境。 目前研究发现IFN-Y的分泌可能对MSC的免疫功能起重要作用。高浓度的IFN-Y可提高MSC的免疫抑制能力，导致MSC对NK细胞的抑制效应占优势。体外炎性因子如TNF- a 和IFN- y也可引起MSC的C0X-2和PGE2表达上调，通过PGE2依赖的方式抑制免疫应答。 炎性因子作用MSC能上调黏附分子VCAM-I和ICAM-I，有助于MSC与T细胞的黏附，从而发挥其T细胞增殖的抑制功能。可以说，MSC所具备的这种免疫抑制特点使之在医学上有巨大的应用潜力，可以应用于器官移植中排异反应以及各种自身免疫性疾病的治疗等多种情况。然而，常规制备的MSC是一个不均一的干细胞群体，并非所有的MSC都具备均一的较强免疫抑制能力，其到目前为止，尚未有某种成熟的公开技术能够从MSC细胞群体中特异性地鉴别并获取较高免疫抑制能力的细胞群体。
关于间充质干细胞表达⑶106 (又叫VCAM-I)的报道不一。有报道说骨髓间充质干细胞表达⑶106阳性，而脐带、脂肪间充质干细胞⑶106表达多为阴性或弱阳性。有人认为STR0-1 /⑶106/⑶146均可作为有效分选干细胞的标记。上述报道是基于其分化能力来说的，如在申请号为200880002860. I的专利中提到用⑶44和⑶106双阳性分选间充质干细胞用于形成牙，申请号为200480014698. 7的专利提到⑶106阳性分选间充质前体细胞可以分化成血管和牙本质等。Ren等在免疫学杂志(Journal of Immunology, 2010 ;184:2321-8)发表的文章中指出，炎症因子可以上调ICAM-I和VCAM-I增强免疫抑制效果， 用IFN-Y能刺激间充质干细胞增加VCAM-I表达，但这同时也会增加HLA-DR的表达。本发明中，我们比较研究了 CD106阳性和阴性的间充质干细胞的成骨和成脂分化能力，发现没有明显的差异，但发现了 CD106阳性的间充质干细胞具有更强的抑制淋巴细胞分泌IFN-Y 的能力，表达更高的水平的C0X2和HGF。进一步，我们发现CD106阳性的间充质干细胞不表达HLA-DR。基于这些研究发现，本发明建立一种⑶106阳性间充质干细胞亚群的鉴定、制备方法，用于鉴别人体内间充质干细胞的免疫调节水平、制备可以治疗移植物抗宿主病和自身免疫性疾病的高免疫抑制活性间充质干细胞制剂。发明内容
针对现有技术中所存在的缺乏有效鉴定和分选高免疫抑制能力的间充质干细胞的方法的技术缺陷，本发明提供如下的解决方案。
利用发明人所发现的CD106阳性细胞的生物学特征，通过免疫学的方法鉴定并分离出CD106阳性的间充质干细胞，该干细胞亚群即具备了相对均一的高免疫抑制能力。具体来说是采用流式细胞仪或免疫磁珠进行纯化间充质干细胞中的CD106阳性细胞，并进行扩增操作。
本发明的操作步骤概括如下(I)从组织中分离出的单个核细胞分离出CD106阳性细胞，再进行贴壁培养操作，获取贴壁的⑶106阳性细胞；(2 )或将从组织中分离出的单个核细胞贴壁培养操作，获取贴壁的间充质细胞，在获得足够的细胞时，再分离出其中CD106阳性细胞；根据上述方法，我们达到了以下效果(I)我们可以得到大量CD106阳性间充质干细胞；(2)得到了具有更强的抑制淋巴细胞增殖和分泌IFN-Y的活性间充质干细胞，可以用于自身免疫系统疾病的治疗。
目前我们检测了成人骨髓、成人脂肪、羊膜、胎盘绒毛膜和脐带来源的细胞，其中成人骨髓、胎盘绒毛膜来源间充质干细胞表达较高水平的CD106。
我们认为CD106阳性的间充质干细胞是一种活化型的间充质干细胞，在骨髓和绒毛膜出现更多的活化型间充质干细胞是为了更好的抑制免疫反应，维持造血环境稳定和避免胎儿被母体排异。一些炎症因子能刺激CD106阴性间充质干细胞表达CD106，但我们认为这是一过性的活化，因为实验发现撤除炎症因子后间充质干细胞的CD106很快就恢复到阴性。
图I :胎盘组织中⑶106+细胞比例，横坐标为⑶106 PE的荧光强度，纵坐标为SSC (侧向角);图2 :CD106+细胞形态，其呈典型的成纤维样细胞形态；图3 :⑶106+细胞流式表型；图4 CD106+细胞成脂和成骨分化；成脂分化用油红0染色，成骨分化用茜素红染色； 图5 :⑶106+细胞和⑶106—细胞C0X2和HGF mRNA表达比较，纵坐标分别为C0X2和HGF mRNA的相对表达量；图6 :⑶106+细胞和⑶106_细胞PGE2和HGF表达比较，纵坐标分别为PGE2和HGF的浓度，单位为纳克/毫升(ng/ml)；图I :⑶106+细胞抑制PHA刺激的淋巴细胞分泌IFN- y，横坐标为PBMC用PHA刺激组、 ⑶106阴性间充质干细胞与PHA刺激的PBMC共培养组、⑶106阳性间充质干细胞与PHA刺激的PBMC共培养组，纵坐标为各组相对PBMC用PHA刺激组的IFN- y表达量；图8 :治疗组和GVHD组的动物生存曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例I :胎盘来源细胞的分离和其中CD106阳性细胞的获取及扩增培养。
I.胎盘的采集，在产妇知情同意的情况采集胎盘。用无菌生理盐水冲洗胎盘，然后将胎盘装入专用的无菌采集盒中，并加入采集液。随后将胎盘4°C运输到实验地点，胎盘不超过48小时。
2.胎盘绒毛膜组织间充质干细胞的分离(1)用机械的方法分离出绒毛膜组织；(2)将组织剪碎至0. 1-1立方厘米，然后用磷酸盐溶液反复冲洗组织块5次以上，使组织块无明显的血凝块及其它杂物；(3)按照与组织体积比1:1的比例加入胶原酶和胰酶的混合物，37°C恒温消化60分钟；(4)通过200目滤网获得单细胞悬液，离心，去掉上清；(5)用 DF12培养基重悬细胞。
3. 0)106阳性细胞的分选按stem cell公司EasySep 正选人PE标记细胞的试剂盒(货号18551)的方法进行，先用藻红蛋白(PE)标记的⑶106抗体标记上述细胞，再用标记有磁珠的抗PE抗体与上述细胞孵育，按试剂盒的方法获得CD106阳性细胞。
4.⑶106阳性间充质干细胞的获得，将第3步获得的细胞用含10%体积比的胎牛血清的DF12培养基重悬，并接种到培养瓶中，每3天换液一次，等细胞融合度达到80-90% 时将细胞用质量比0. 25%胰酶消化后按1:3传代培养，将细胞扩增到所需的数量后进行冻存或使用。
5.流式细胞仪分析间充质干细胞中CD106阳性细胞的比例及间充质干细胞相关标记(⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、⑶166)的检测。将分离后的细胞按每个样本2X IO5 细胞分管，按专业人士熟知的方法使用抗体标记后，用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬到400 u L 装入流式管。用BD公司FACSCalibur流式细胞分析仪检测、分析。
6.成骨、成脂分化以4X IO4细胞/孔接种于6孔板内。培养24小时后细胞贴壁，弃去培养液。
成脂诱导体系(MDM培养基、10% FBS、10-6M地塞米松、0. 5 mM 3-异丁基-I-甲基黄嘌呤、10 yl/ml胰岛素、60 UM吲哚美辛、2 u M/ml L-谷氨酰胺)继续培养。每3天换液I次，共诱导21天。弃掉培养液，PBS洗2次，10%甲醛固定30分钟。PBS再洗3次。 加入0.2%油红0染液，37°C染色30分钟。吸出染液回收，PBS洗3次。显微镜下观察并照相。
成骨诱导体系(MDM培养基、10% FBS、10-7M地塞米松、0. 2 mM 2-磷酸抗坏血酸、 10 mM ￠-磷酸甘油、2 u M/ml L-谷氨酰胺和100 U/ml青霉素/链霉素)继续培养。每3 天换液I次，共诱导14-21天。培养21天，弃培养液，PBS洗2次。甲醇丙酮(I: I)室温固定10分钟，PBS洗3次。加入0.5%茜素红，37°C染色30分钟，弃染液，PBS洗3次。显微镜下观察并照相。
结果我们分离的胎盘组织原代细胞中有0. 36%的⑶106阳性细胞(见图1)，分离的CD106阳性细胞经过贴壁培养，获得间充质干细胞，具有成纤维细胞形态(见图2);通过流式检测⑶106阳性细胞比例为94%，⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、⑶166的阳性率均在 99%以上(见图3)。诱导分化鉴定所获得CD106阳性细胞具有向成骨、成脂的分化能力(见图4)。
实施例2 CD106阳性间充质干细胞的分选。
将扩增后的间充质干细胞，通过使用专业人士都熟知的磁珠分选方法，从胎盘来源细胞分理出⑶106阳性细胞。
结果通过磁珠分选后，获得的⑶106阳性细胞纯度为97. 91%。
实施例3 :⑶106阳性间充质干细胞表达更高的C0X2/PGE2、HGF。
将CD106阳性间充质干细胞与CD106阴性间充质干细胞分别扩增到所需数量， 吸取培养上清留用，再用专业人士所熟知的方法提取上述两种细胞的mRNA，并逆转录成 cDNA，用定量聚合酶链反应(rt-PCR)比较两种细胞C0X2和HGF的mRNA表达量。
将上步留用的培养上清用专业人数熟知的酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测其中 PGE2和HGF的含量。
结果⑶106+间充质干细胞比⑶106-间充质干细胞表达更高水平的C0X2和HGF mRNA (见图5)，⑶106+间充质干细胞比⑶106_间充质干细胞表达更高水平的PGE2和HGF (见图6)。
实施例4 :⑶106阳性间充质干细胞抑制PHA刺激的淋巴细胞分泌IFN- y。
I.分别收集正常培养的CD106+MSC和CD106—MSC，钴60照射后计数。用含10%FBS 的RPMI 1640培养液悬浮后种植于平底96孔细胞培养板，按IO4个/孔分组，每组设3个复孔，于37°C、5%C02，饱和湿度培养箱内用普通培养基培养24h。
2.无菌条件下取健康成人静脉血5ml，肝素抗凝，Ficoll分离PBMC并计数，将细胞重悬于含10%FBS的RPMI 1640培养液中，计数并将浓度调节为2X 106/mL。
3.将PBMC接种于前述96孔细胞培养板，与MSC进行共培养。每孔中IO5个细胞， 同时加入10ug/mlPHA。
4.用RPMI 1640培养液将每孔体积调整为200ul，37°C、5%C02，饱和湿度培养箱内用普通培养基培养72h后收集各个组的上清，用ELISA检测每组培养上清的IFN- y浓度。
结果⑶106+和⑶106—间充质干细胞均能明显抑制PHA刺激的淋巴细胞分泌 IFN-Y，而⑶106+间充质干细胞的抑制效果明显好于⑶106—间充质干细胞(p < 0. 01)(见图7)。
实施例5 CD106阳性间充质干细胞治疗小鼠移植物抗宿主病(GVHD)。
I. BAL B/c小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型的建立I.I造模前BAL B/c小鼠用60Co y射线照射清髓小鼠以60Co y射线致死量全身辐照(照射剂量为lO.OGy)。运输时全部小鼠装在无菌包装盒中，照射前于超净间内将小鼠转移到专用的小鼠铅盒中，保证小鼠不被污染。
I. 2 C57BL/6供体小鼠骨髓细胞(BMC)的制备(每只动物约可取4-6 X IO7BMC): 小鼠断髓处死，置于75%酒精中浸泡5分钟，无菌条件下取小鼠股骨、胫腓骨，反复冲洗骨髓，过滤，制成单细胞悬液；室温IOOOrpm离心5分钟，用无菌的PBS洗2次；以台盼蓝染色法进行活细胞计数，细胞活性率在99%以上；调节细胞浓度为I X 108/ml，室温放置备用。
1.3 C57BL/6供体小鼠脾脏细胞(SC)的制备(每只动物约可取5-20X 107SC):小鼠断髓处死，置于75%酒精中浸泡5分钟，无菌条件下取脾脏，置200目不锈钢滤网中研磨， RPMI1640冲洗，制成单细胞悬液；室温IOOOrpm离心5分钟，洗2次；以台盼蓝染色法进行活细胞计数，细胞活性率在99%以上；调节细胞浓度为I X 108/ml，室温放置备用。
1.4建立aGVHD模型制备好的BMC和SC悬液，以I : I混合，即BMC取0. Iml，SC 取0. 1ml，尾静脉输注给经过照射的BAL B/c受体小鼠，输注细胞量为2.0X107个/只小鼠， 总体积0. 2ml。
2. MSC 用于治疗 aGVHD传代培养的CD1061SC和CD10611SC，消化、计数；用含有33单位/ml低分子肝素钙的生理盐水调整细胞浓度为I. OX 107/ml，共I. 5ml ;按照0. Iml/只动物的剂量，给予小鼠尾静脉输注；给药时间为造模后第3天和第6给两个治疗组输注MSC。对照GVHD组则注射同体积含有33单位/ml低分子肝素钙的生理盐水。
3.疗效的评价采用生存率为评价指标每天观察并记录各组动物的存活状况，用于动物生存曲线的绘制以评价模型与治疗效果。
结果小鼠aGVHD模型用⑶106+细胞和⑶106_细胞治疗后的生存曲线(见图8)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种干细胞亚群的鉴定方法，其特征是，利用技术手段鉴定表面标志物CD106为阳性的细胞。
2.如权利要求I所述的鉴定方法，其特征是，所述鉴定表面标志物CD106的技术手段是免疫学方法。
3.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征是，所述免疫学方法是流式细胞技术。
4.如权利要求1-3所述的鉴定方法，其特征是所述CD106阳性细胞为间充质干细胞。
5.如权利要求4所述的鉴定方法，其特征是所述间充质干细胞为人间充质干细胞。
6.如权利要求5所述的鉴定方法，其特征是所述人间充质干细胞的来源包括人胎盘组织及骨髓组织。
7.如权利要求6所述的鉴定方法，其特征是所述人间充质干细胞的来源为人胎盘组织。
8.如权利要求1-3、5-7所述的鉴定方法，用于鉴定分离相对于天然状态下的间充质干细胞具备更强免疫抑制能力的间充质干细胞亚群。
9.一种CD106阳性细胞的制备方法，其特征是采用技术手段将利用权利要求1-3、5-7 所述鉴定方法鉴定的CD106阳性细胞亚群由天然组织中分离。
10.如权利要求4所述的分离方法，其特征是所述技术手段为免疫学方法。
11.如权利要求5所述的分离方法，其特征是所述免疫学方法包括流式细胞仪分选、免疫磁珠分离。
12.—种CD106阳性细胞，其特征是由权利要求9所述的制备方法制备的。
13.如权利要求12所述的⑶106阳性细胞，其特征是表达细胞表面标记还包括⑶29、 CD44、CD73、CD90、CD105、CD166。
14.根据权利要求12所述的CD106阳性细胞，其特征是所述CD106阳性细胞为间充质干细胞，具有成骨、成脂分化能力。
15.根据权利要求12所述的CD106阳性细胞，其特征是所述CD106阳性间充质干细胞与CD106阴性间充质干细胞相比，表达更高的前列腺素E2 (PGE2)和HGF，具有更强的免疫抑制作用和促血管新生功能。
16.根据权利要求12-15所述的CD106阳性细胞，其在人体骨髓细胞中的数量可以反映体内免疫调控水平的高低。
17.根据权利要求12-15所述的CD106阳性细胞，可以用于制备治疗GVHD和自身免疫系统疾病的药物。
18.一种分离人间充质干细胞亚群的方法，包括以下步骤从组织原代分离出的单个核细胞分离出CD106阳性细胞，再进行贴壁培养操作，获取贴壁的⑶106阳性细胞；或将从组织原代分离出的单个核细胞贴壁培养操作，获取贴壁的间充质细胞，在获得足够的细胞时，再分离出其中CD106阳性细胞。
全文摘要
本发明公布了一种CD106阳性间充质干细胞的鉴定、制备方法及其应用。通过免疫学的手段从骨髓或胎盘等组织分离出的单个核细胞鉴定并分离出CD106阳性细胞，再进行贴壁培养操作，获取贴壁的CD106阳性细胞；或将骨髓或胎盘等组织分离出的单个核细胞贴壁培养操作，获取贴壁的间充质细胞，在获得足够的细胞时，再分离出其中CD106阳性的间充质干细胞。这些CD106阳性为间充质干细胞，贴壁生长，表达间充质干细胞相关免疫表型，具有成骨、成脂等分化能力。与CD106阴性间充质干细胞相比具有更强的免疫抑制能力，可以更好的抑制淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ，可以用于GVHD和自身免疫系统疾病的治疗。
文档编号G01N33/53GK102539736SQ20111042254
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者韩忠朝 申请人:北京汉氏联合生物技术有限公司