专利名称：一种新型酯酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种从海底泥中提取的新型酯酶及其表达载 体、重组酯酶及重组酯酶在降解拟除虫菊酯农药残留中的应用。
背景技术：
拟除虫菊酯类农药是继有机氯、有机磷和氨基甲酸酯类农药后根据天然除虫菊素 的结构人工合成的一类仿生杀虫剂，其出现代表杀虫剂工业进入了超高效杀虫剂时代。拟 除虫菊酯类农药的杀虫机理主要是影响昆虫的神经系统，杀虫活性强，杀虫效力一般比有 机磷杀虫剂大100倍以上，且速效性好同时用量少、低残留，被广泛用于粮食、蔬菜和果树 等多种作物。长期接触拟除虫菊酯类农药即使是低剂量也会引起慢性疾病，有些类型还有致 畸、致癌作用。而且菊酯类农药对水生动物的毒性较大，联合国粮农组织和《联邦食品安全 法》已对其多种农药作出了进出口限制。随着人们生活水平的提高、环护意识的增强以及残 留农药分析技术的进步，人们迫切的需要无农药残留污染的安全食品。因此，寻找一种有效 方法消除或降低在农作物、食品和环境基质中拟除虫菊酯类农药残留已成为当前迫切需要 解决的问题。目前，有关拟除虫菊酯类农药的降解主要有物理、化学和生物三种方法。由于生物 法较物理和化学法处理残留农药具有经济、高效、无二次污染等优点，成为当今的主要研究 热点。利用微生物降解残留农药大多数是依靠胞内酶的酶解作用，降解酶去除残留农药降 解具有作用底物浓度低、环境适应能力强和安全无毒等优点，但由于野生菌株大多产酶能 力有限、发酵周期长、纯化复杂。因此，克隆农药降解酶基因，并利用工程菌作生物反应器来 生产农药降解酶是将来主要的研究方向。目前已从可培养微生物中克隆到多种农药降解酶 基因，然而这些降解酶基因在工程菌中表达时存在不可溶表达或表达条件要求苛刻问题， 而且重组降解酶的低温酶活性和稳定性无法满足实际应用要求，不能达到快速有效降解残 留农药的目的。为了解决这些问题，迫切需要从自然界中寻找更有潜力的菊酯类农药降解 酶。宏基因组学(Metagenomics)是以特定生态环境中微生物群体基因组的总和作为 研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，通过宏基因组文库的构建及基因克隆、 异源表达等基本研究策略，筛选出有用的新基因及其产物，近年来随着微生物学和现代生 命科学的迅猛发展而兴起的一门新兴学科。宏基因组学技术在挖掘和利用未培养微生物资 源和筛选新颖生物活性物质方面表现出巨大的潜力，为生命科学提供了强有力的新方法， 已成为当前国际上微生物学研究的前沿领域和热点。至今国内外学者已经通过该技术克隆 到如淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、酯酶等新基因，这些酶具有新颖的酶学特性及工业应用 潜力。因此，采用该方法使充分利用环境中蕴藏的大量宝贵基因资源成为可能。到目前为 止，国内外尚未有利用宏基因组技术从海底泥中发现新型广谱高效降解拟除虫菊酯类农药 降解酶的研究报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种新型酯酶的DNA。本发明的第二个目的在于提供上述新型酯酶的宏基因组学克隆方法。本发明的第三个目的在于提供含有上述新型酯酶的DNA的表达载体。本发明的第四个目的在于提供利用上述表达载体构建的重组酯酶及其制备方法。本发明的最后一个目的在于提供上述重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药残留中 的应用。本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的一种新型酯酶的DNA，它的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明提供的上述新型酯酶，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的一种新型酯酶的宏基因组学 克隆方法，提取海底泥的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切，连接pUC118载体， 电击转化大肠杆菌DH5 α高效感受态建立宏基因组文库，通过点平板和滴加底物显色法快 速筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的一种含有上述新型酯酶的 DNA的表达载体。本发明的第四个目的是通过如下技术方案来实现的一种重组酯酶的制备方法， 包括用上述表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酯酶。上述重组酯酶的制备方法中，寄主细胞是大肠杆菌。上述重组酯酶的制备方法，其具体过程为包括用上述表达载体的目的片段经 BamHI, HindIII双酶切，与pET_28a(+)载体连接，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，经IPTG诱 导，得到高效可溶性表达。所述的IPTG终浓度为0. 1-1. 3mM，诱导温度为18_37°C。本发明提供的重组酯酶，包括用上述表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养 物中获得重组酯酶的步骤的方法制备。本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的本发明所述重组酯酶在降 解拟除虫菊酯类农药残留中的应用。本发明的有益效果①.本发明从海底泥样品构建好的宏基因组文库中得到一个新的酯酶的DNA序 列，通过基因工程技术对其功能研究，发现该序列在大肠杆菌中高效可溶表达，经蛋白纯化 及SDS-PAGE电泳，得到一条单一的蛋白条带，初步确定分子量约为31. 2KDa。②.本发明将SEQ ID NO. 1所示的DNA序列克隆到原核表达载体上，转化大肠杆 菌感受态细胞，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白，研究其酶学性质，结果如下(1)在大肠杆菌表达体系中，该重组蛋白具有高效可溶性表达。(2)用对硝基苯酚乙酸酯为底物，测得重组蛋白的最适反应温度为40°C，在温度 低于60°C非常稳定，60°C保温2h后，相对酶活性保持在80%以上，在20°C和10°C条件下， 分别为最高酶活性的76%和37%，表明该酶具有热稳定和冷适应性；最适反应pH为7. 0， 在pH 5. 5-9.0，酶的相对活力保持在80%以上，说明其有较宽的pH酶解范围；测定金属离子和生化试剂对酶活力影响时发现，ImM Al3+对重组酯酶F816的酶活力有明显提高作用； 1% (w/v)的TritonX-100和Tween-80对其酶活力均有不同程度的提高作用；Hg2+、Ag+和 SDS则明显的抑制酶活力，其它离子和生化试剂对酶活性没有明显的影响。③.本发明通过测定其酶学性质时发现对lmg/L的氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊 酯和溴氰菊酯有强降解作用，测定重组蛋白降解氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊 酯，结果表明其降解率均超过90%，因此在去除果蔬拟除虫菊酯类农药残留方面有广阔的 应用前景。
图1为实施例1中的SDS-PAGE电泳图；其中，M为标准蛋白分子量maker，1为重组蛋白粗提物，2为纯化的重组蛋白；图2为重组蛋白降解底物对硝基苯酚乙酸酯的最适温度和热稳定性结果折线图；其中1为最适温度折线图，2为热稳定性折线图；图3为重组蛋白降解底物对硝基苯酚乙酸酯的最适pH和pH稳定性结果折线图；其中1为最适pH折线图，2为pH稳定性折线图；图4为氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解气相色谱图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。实施例1宏基因组文库的建立和阳性克隆子的获得、基因克隆与表达1、总DNA的提取称取6g 样品，加入 13. 5mL DNA 提取缓冲液(0. IM Tris,0. IM EDTA-Na,0. IM Na3PO4,1. 5M NaCl，CTAB，pH值8. 0)，剧烈振荡 3_5min，加入 200 μ L溶菌酶(100mg/ml)， 反复颠倒5-6次，37°C水浴30min，加入1. 5ml 20% SDS，65°C水浴Ih (期间每隔15min上 下颠倒几次)，8000r/min离心5min，取上清液，用等体积氯仿抽提2次，16000r/min离心 IOmin,取上清，加入0. 6倍体积的异丙醇，室温放置2h，20000r/min离心20min，弃上清，沉 淀加5mL预冷的70%乙醇，20000r/min离心lOmin，收集DNA沉淀，风干，用适量TE缓冲液 溶解。2、试剂盒法纯化DNA 按照胶回收试剂盒说明书进行。3、宏基因组电泳检测用琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的纯度和质量。4、酶切总DNA 用限制性内切酶BamHI部分酶切总DNA，回收2_8kb的酶切片段，方 法同试剂盒法纯化DNA。5、酶切片段的电泳检测方法同宏基因组电泳检测。6、酶切片段的链接将回收得到的酶切片段和pUC118/BamHI (BAP)载体连接过 夜，向连接产物中加入0. 6倍体积的异丙醇，室温沉淀1. 5h，14000r/min离心20min，弃上清 并向沉淀中加入70%无水乙醇洗涤2次，风干并加入适量dd H2O重溶。7、连接产物的转化吸取5yL的连接产物加入到IOOyL的大肠杆菌DH5a高效感受态中，2500V/ cm(Eppdorf2510 电击仪)电击 1 次，46°C热激 6min，37°C，180rpm 摇床培养 45_60min，吸取30-40μ L涂布于LB琼脂平板，37°C培养过夜。根据平板上菌落数目将剩余的转化产物涂布 含氨苄青霉素(100 μ g/ml)、IPTG(ImM)和X_gal (24 μ g/ml)的LB平板。由此构建了一个 库容量达15000个转化子、多样性好的宏基因组文库。8、文库筛选和阳性克隆子的鉴定将文库中所有的白板单菌落点种至两块含氨苄青霉素(100yg/ml)、IPTG(ImM) 的LB固体培养基中，37°C培养24-48h，选择其中一块平板并将X-cap(80y g/ml)滴至菌落 表面及周围，37°C放置30min后观察颜色反应。产生蓝色反应的即为阳性克隆。通过筛选 得到一株阳性克隆子。从另一块平板中将阳性克隆子挑出并接种至IOmL含氨苄青霉素(100 μ g/ml)的 LB液体培养基中，37°C、220r/min摇床培养过夜，取2mL菌体进行质粒提取，对插入片段测 序，将测定的序列经过NCBI的BLASTn软件分析比较，发现该DNA由825个碱基组成，其核酸 序列如SEQ ID NO. 1所示，该DNA编码的多肽，含274个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ IDN0. 3 所示，将其命名为F816。其中SEQ ID NO. 2为SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 3的对照图。9、基因片段的克隆根据测序结果设计一对引物F1和F2，引物两端引入能插入pET_28a(+)载体的 HindIII和BamHI酶切位点，引物序列如下Fl 5' -CGCGGATCC ATG AGT GAG CTG ACA TCA ATC TCC GF2 5' -CCCAAGCTT TCA GGG GGC CAG CAA CTC利用两条引物，以质粒pUC118-F816为模板进行PCR扩增反应，PCR体系如下
溶液体积(μ )
模板(IOOng)1
dNTPMix (2.5 mM)4
引物 Fl(IOpM)1 引物 F2(10pM)权利要求
一种新型酯酶的DNA，其特征是它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种新型酯酶，其特征是它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.权利要求1或2所述的新型酯酶的宏基因组学克隆方法，其特征是提取海底泥的 总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切，连接pUCl 18载体，电击转化大肠杆菌DH5 α 高效感受态建立宏基因组文库，通过点平板和滴加底物显色法快速筛选得到阳性克隆子， 经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。
4.一种包含权利要求1所述的新型酯酶的DNA的表达载体。
5.一种重组酯酶的制备方法，其特征是包括用权利要求4所述的表达载体转化寄主 细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酯酶。
6.根据权利要求5所述的重组酯酶的制备方法，其特征是其中寄主细胞是大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的重组酯酶的制备方法，其特征是其具体过程为包括用权利 要求4所述的表达载体的目的片段经BamHI、HindIII双酶切，与pET_28a(+)载体连接，转 化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达。
8.根据权利要求7所述的重组酯酶的制备方法，其特征是所述的IPTG终浓度为 0. 1-1. 3mM，诱导温度为 18-37°C。
9.一种重组酯酶，其特征是包括用权利要求4所述的表达载体转化的寄主细胞，培养 转化体，从培养物中获得重组酯酶的步骤的方法制备。
10.权利要求9所述的重组酯酶在降解拟除虫菊酯农药残留中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新型酯酶的DNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。它的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。还公开了含上述新型酯酶DNA的表达载体和重组酯酶及重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用，该新型酯酶及重组酯酶在大肠杆菌表达体系中具有高效的可溶性表达，且该重组酯酶对氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等具有高效降解作用。
文档编号A62D101/04GK101985627SQ20101054720
公开日2011年3月16日 申请日期2010年11月17日 优先权日2010年11月17日
发明者刘孝龙, 刘玉焕, 梁卫驱, 范新炯 申请人:中山大学