固定化酯酶E.coli BioH催化合成维生素A棕榈酸酯的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及维生素A棕榈酸酯的合成方法，特别是固定化酶催化合成维生素A棕榈酸酯的方法。
【背景技术】
[0002]维生素A棕榈酸酯已被广泛用作药物、食品添加剂和饲料添加剂等，已有多种合成方法的相关报道，这些方法包括由维生素A醇或维生素A低级脂肪酸酯为原料制备维生素A棕榈酸酯的方法，涉及多种反应路线。
[0003]日本专利JP62，248495公开的合成路线为:维生素A醋酸酯和棕榈酸在脂肪酶的作用下得到维生素A棕榈酸酯；英国专利GB 816224公开的合成路线为:维生素A醋酸酯和棕榈酸烷基酯在甲醇钠的作用下得到维生素A棕榈酸酯；英国专利GB 1293041公开的合成路线为:维生素A醇和棕榈酰氯在三乙胺的存在下得到维生素A棕榈酸酯；国内专利CN102363606 A公开的合成路线为:维生素A醇与卤代酰胺反应得到维生素A卤代物，卤代物与棕榈酸盐溶解反应制得到维生素A棕榈酸酯。
[0004]上述制备维生素A棕榈酸酯的方法具有下列问题:
[0005]日本专利JP62，248495公开的方法:通过脂肪酶催化，由维生素A醋酸酯与棕榈酸反应制成维生素A棕榈酸酯。反应可以在室温下进行，但是该酶催化的方法必须在较低的浓度下进行，生产能力低，维生素A棕榈酸酯转化率一般在80%左右并且反应产物中含有脂肪酶和维生素A醋酸酯等，使后续分离较困难，难以得到高质量高收率的维生素A棕榈酸酯。
[0006]英国专利GB 816224公开的方法:棕榈酸烷基酯与维生素A醇的酯交换反应是一个可逆反应，反应过程生成的烷基醇必须及时蒸馏除去才能打破平衡，因此反应很难进行完全。由于反应是在碱性和加热的条件下进行，会导致反应产物颜色较深，质量和稳定性较差。
[0007]英国专利GB 1293041公开的方法:维生素A醇与棕榈酰氯反应制备维生素A棕榈酸酯。此方法在有机碱存在下进行反应，产品的收率一般在94%左右，因为维生素A醇高度不稳定，在酰氯等酸性介质及高温的条件影响下容易被破坏形成脱水维生素A和顺式维生素A酯，因而产品热稳定性较差。
[0008]国内专利CN 102363606 A公开的方法:维生素A醇与卤代酰胺反应得到维生素A卤代物，卤代物与棕榈酸盐溶解反应制得到维生素A棕榈酸酯。该方法在反应过程使用卤族原料及吡啶，反应条件较酰氯法温和，收率可达95%，但产品由于卤族离子的残留对产品的热稳定性有较大影响。
【发明内容】
[0009]针对文献报道的维生素A棕榈酸酯合成方法中所存在的问题，本发明的目的是提供一种收率高、纯度高、能耗低、对环境友好的生物酶催化合成维生素A棕榈酸酯方法。
[0010]一种固定化酶催化合成维生素A棕榈酸酯的方法，该方法包括:
[0011]以维生素A醋酸酯和低级醇为原料，在固定化酯酶E.coli B1H催化下，于20-60°C、减压蒸馏条件下进行酯交换反应直到维生素A醋酸酯残留低于0.5%，反应液过滤得到的固定化酯酶E.coli B1H回用，滤液减压下蒸出过量低级醇，得到高纯度的维生素A醇；将上述维生素A醇与棕榈酸在有机溶剂中经固定化酯酶E.coli B1H催化，在减压蒸馏条件下于20?60°C进行酯化反应至维生素A醇转化率达到99.0%以上，反应液冷却、过滤得到的固定化酯酶E.coli B1H和过量棕榈酸回用，滤液减压下蒸出有机溶剂，得到维生素A棕榈酸酯。
[0012]所述的固定化酯酶E.coli B1H，基因信息及来源由以下公开发表文献获得:Tang Xiaolingj Liu Jij Yu Hongwei' Cloning, screening and characterizat1n ofenant1selective ester hydrolases from Escherichia coli K-12, World Journal ofMicrob1logy and B1technology，2011 (27)，129-136.
[0013]所述的固定化酯酶E.col i B1H的固定化方法来自以下公开发表文献:Ren Gangfengj Yu Hongwei' Oriented adsorptive immobilizat1n of esteraseB1H based on protein structure analysis,B1chemical EngineeringJournal, 2011 (53), 286-291.
[0014]优选地，固定化酯酶E.coli B1H中E.coli B1H酶的重量含量为15?25%，这时酶的含量高，而且酶与载体结合牢固。
[0015]优选地，所述的酯交换反应的维生素A醋酸酯、低级醇、固定化酯酶E.coli B1H投料比例为100g:500?2000mL:10?100g。适当过量的低级醇不仅能促进反应往正方向进行，也可以作为反应溶剂有效分散维生素A醋酸酯和固定化酯酶E.coli B1H;但低级醇过量太多降低了设备利用率，也使反应物、催化剂浓度降低，不利于反应进行；固定化酯酶E.coli B1H用量增加有促进反应的作用，但过多则不利于分散。
[0016]优选地，所述的酯化反应维生素A醇、棕榈酸、有机溶剂、固定化酯酶E.coli B1H投料比为10(^:90?18(^:800?20001^:10?10(^。适当过量的棕榈酸能促进反应往正方向进行，但过量太多则不利于回收；有机溶剂用于分散反应物和固定化酯酶E.coli B1H,用量太多降低了设备利用率，也使反应物、催化剂浓度降低，不利于反应进行；固定化酯酶E.coli B1H用量增加有促进反应的作用，但过多则不利于分散。
[0017]优选地,所述的酯交换反应或酯化反应的反应温度为25V?40°C,能最好地保持固定化酯酶E.coli B1H的活性。
[0018]所述酯交换反应的低级醇为甲醇、乙醇的至少一种，生成的醋酸酯沸点低，容易蒸出；所述酯化反应的有机溶剂为戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷、二氯甲烷、甲苯中的至少一种，减压蒸馏时有较好的带水能力，且不与水相溶。
[0019]本发明采用维生素A醋酸酯先与低级醇经过充分酯交换反应得到维生素A醇和醋酸低级醇酯，维生素A醇再与棕榈酸酯化反应，得到维生素A棕榈酸酯。醋酸低级醇酯在酯交换反应过程中通过与低级醇一起蒸出，得到高纯度的维生素A醇；维生素A醇与棕榈酸酯化反应，其副产物为水，通过有机溶剂蒸馏带水的方式，加速反应正向进行。
[0020]本发明的技术方案避免酶与酸性、碱性物质接触而造成酶结构的破坏，从而大大提高了酶的套用次数，降低酶的使用成本；酶固定化后，经过简单的过滤就能与反应液分离，避免了酶的流失以及维生素A棕榈酸酯被酶污染。生产过程中反应条件温和、能耗低、无废水、转化率高，同时产品纯度高、稳定性好，避免了前述维生素A棕榈酸酯合成方法存在的缺陷。
[0021]本发明方法制备的维生素A棕榈酸酯，外观为淡黄色油状物。采用美国药典USP28的方法进行分析，效价为179?180万IU/g，相当于含量98%?99%，可广泛用作药物、饲料添加剂、食品添加剂等。
【附图说明】
[0022]图1为维生素A棕榈酸酯转化率与固定化酯酶E.coli B1H套用次数的关系图，表明酶套用40次以上仍然保持相同的活性。
【具体实施方式】
[0023]本发明实施例使用的固定化酯酶E.coli B1H，固定化方法来自以下公开发表文献:Ren Gangfeng, Yu Hongwei*, Oriented adsorptive immobilizat1n ofesterase B1H based on protein structure analysis, B1chemical EngineeringJournal, 2011 (53), 286-291.
[0024]对比例
[0025]在1000ml的四口烧瓶中，将30g维生素A醋酸酯和23.4g棕榈酸溶解于500ml正己烷，加入6g固定化酯酶E.coli B1H(酯酶E.coli B1H的重量含量为20%)，在35°C下反应6个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为96.56%，反应较慢，转化率低。
[0026]实施例1维生素A醇的合成
[0027]在100ml的四口烧瓶中，加入30g维生素A醋酸酯和400ml乙醇，再加入6g固定化酯酶E.coli B1H (酯酶E.coli B1H的重量含量为15%)，在35°C、-0.08MPa减压蒸馏条件下反应18个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为0.43%。
[0028]实施例2维生素A醇的合成
[0029]在100ml的四口烧瓶中，加入30g维生素A醋酸酯和400ml乙醇，再加入18g固定化酯酶E.coli B1H (酯酶E.coli B1H的重量含量为20%)，在40°C、-0.07MPa减压蒸馏条件下反应10个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为0.39%。
[0030]实施例3维生素A醇的合成
[0031]在100ml的四口烧瓶中，加入30g维生素A醋酸酯和600ml甲醇，再加入18g固定化酯酶E.coli B1H (酯酶E.coli B1H的重量含量为20%)，在20°C、-0.08MPa减压蒸馏条件下反应16个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为0.21%。
[0032]实施例4维生素A醇的合成
[0033]在100ml的四口烧瓶中，加入30g维生素A醋酸酯和600ml甲醇，再加入30g固定化酯酶E.coli B1H (酯酶E.coli B1H的重量含量为25%)，在35°C、-0.075MPa减压蒸馏条件下反应3个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为0.32%。
[0034]实施例5维生素A醇的合成
[0035]在100ml的四口烧瓶中，加入30g维生素A醋酸酯和150ml甲醇，再加入3g固定化酯酶E.coli B1H (酯酶E.coli B1H的重量含量为25%)，在60°C、-0.03MPa减压蒸馏条件下反应18个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为0.34%。
[0036]实施例6维生素A醇的合成
[0037]在100ml的四口烧瓶中，加入30g维生素A醋酸酯和300ml甲醇，再加入6g固定化酯酶E.coli B1H (酯酶E.coli B1H的重量含量为25%)，在50°C、-0.05MPa减压蒸馏条件下反应8个小时，反应液取样用HPLC检测，维生素醋酸酯残留为0.39%。
[0038]实施例7维生素A醇的合成
[0039]在100ml的四口烧瓶中，加入40g维生素A醋酸酯和600ml甲醇，再加入8g固定化酯酶E.coli B1H (酯酶E.coli B1H的重量含量为20%)，在35°C、-0.075MPa减压蒸馏条件