一种人羧酸酯酶ces2的高特异性荧光探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种人羧酸酯酶CES2 (Carboxylesterase2) 的高特异性荧光探针及其应用。
【背景技术】
[0002] 羧酸酯酶（Carboxylesterase，CES)是机体内重要的一相水解代谢酶，催化多种 内源性和外源性化合物发生酯键断裂，释放出极性的醇和羧酸分子片段，后者进而被体内 CYP450或UGTs等其他代谢酶继续催化代谢，使药物分子更有效地被排出体外。多种结构中 含有酯键的药物分子，如盐酸伊立替康（irinotecan，CPT-11)、奥司他韦（达菲)、氯吡格雷 等均被羧酸酯酶催化进行活化或代谢消除。
[0003] 人体内介导药物代谢的羧酸酯酶主要分布在2个家族：CES1和CES2,其中CES1又 可继续被分为CESlb和CESlc两种亚型。CES1和CES2具有不同的组织分布特异性及底物 选择性，人的肝脏中主要分布表达CES1，同时表达一定量的CES2,而小肠中则基本以CES2 亚型为主，只有极少量的CES1分布。近年来发现多种肿瘤细胞中CES2的表达水平上调，可 借助此特征设计经CES2特异性水解的抗肿瘤前体药物实现靶向选择性杀伤肿瘤细胞的目 的。此外，多数口服前药需先经过肠道才能被吸收进入血液循环，因此肠道中CES2酶对酯 类药物的代谢被认为是其首过代谢的重要组成部分，CES2酶活的差异对于前体药物的生物 利用度具有十分重要的影响。此外，有些经静脉给药的前体药物，如盐酸伊立替康，会经过 胆汁排泄被分泌到肠道中，继而被肠道中的CES2催化水解释放出毒性代谢产物SN-38,后 者被认为是导致伊立替康迟发型腹泻副作用的主要原因。因而，建立基于探针的高通量技 术手段，对于筛选CES2的高效抑制剂并将其应用于减缓伊立替康导致的迟发型腹泻，以及 对CES2功能的定量检测都十分重要。
[0004] 本发明提供了一类3-羟基黄酮酯类衍生物及其作为CES2酶荧光探针底物的应 用，其经羧酸酯酶CES2水解后可生成荧光发射波谱不同于原型的水解产物。该酶促反应具 有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种人羧酸酯酶CES2 (Carboxylesterase2，CES2)的特异 性荧光探针底物及其应用，该底物原型和水解产物的荧光发射波长具有明显差异，且产物 更易检测。利用该探针反应可对多种生物体系中CES2的分布和功能进行定量评价。
[0006] 本发明提供了一种人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针底物，该底物的酯键可 被CES2特异性水解为相应水解产物并显示与底物不同的发射波谱；
[0007] 该底物是以3-羟基黄酮类化合物为原料，通过酯化反应获得相应3-羟基酯类衍 生物，其结构通式如式（1)所示，其中，R为苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对 己基丙基、对硝基苯基、对氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、（4-苯基)苯基、4-乙氧基 苯基取代基中的一种。
[0008]
【主权项】
1. 一种人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针底物，其特征在于：该底物的酯键可被 CES2特异性水解为相应水解产物并显示与底物不同的发射波谱； 该底物为3-羟基黄酮酯类衍生物，其结构通式如式（1)所示，其中，R为苯基、对甲基苯 基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基丙基、对硝基苯基、对氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻 吩基、（4-苯基）苯基、4-乙氧基苯基取代基中的一种。
2. 权利要求1所述人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针底物的应用，其特征在于：该 底物作为CES2的特异性底物，可利用其水解反应活性，通过定量检测单位时间内水解产物 的生成量来测定不同酶源中CES2的活性。
3. 按照权利要求2所述人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针底物的应用，其特征在 于：所述酶源为重组表达的CES2单酶、人或动物组织制备液、或各类组织细胞生物样品。
4. 按照权利要求2所述人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针底物的应用，其特征在 于：所述水解反应体系pH介于5. 5~10. 5之间；探针底物的浓度介于1/10~IOKm之间； 孵育体系反应温度介于20~60°C之间，同时水解产物的转化率应介于0. 1%~20%之间。
5. 按照权利要求2所述人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针底物的应用，其特征在 于：该探针底物及其水解产物均具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速 灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长308nm，在380~560nm进行荧光发射谱的检测。
6. 按照权利要求2所述人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针底物的应用，其特征在 于：该特异性探针底物及其水解反应可用于CES2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评 价。
【专利摘要】一种人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针及其应用，该特异性探针底物是3-羟基黄酮类化合物酯类衍生物，其可用于检测不同生物样品中CES2的存在与否及其活力的定量测定。酶活具体测定流程如下：选择3-羟基黄酮酯类衍生物水解反应为探针反应，选择适宜底物浓度在线性反应区间内通过定量检测单位时间内其水解代谢产物3-羟基黄酮的生成量来测定各生物样品、细胞、在体及整体器官中CES2酶的实际活性。本发明不仅可用于不同来源生物样本中CES2酶活的定量评估，此外借助该探针反应还可用于体外快速筛选CES2的抑制剂。
【IPC分类】C12Q1-04, C09K11-06, G01N21-64, C07D311-30, C12Q1-44
【公开号】CN104650854
【申请号】CN201310587411
【发明人】杨凌, 冯磊, 崔京南, 葛广波, 刘兆明
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年11月19日