专利名称：一种热稳定性羧酸酯酶基因、编码蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种羧酸酯酶基因、编码蛋白及其应用，特别是具有热稳定性 的羧酸酯酶基因、编码蛋白及其应用。
技术背景酯酶(estemses， EC 3丄1.X)是一大类能够催化酯键水解和形成的酶类，广泛 分布于动物、植物和微生物。酯酶主要包括羧酸酯酶(carboxylesterases，carboxyl ester hydrolases, EC 3. l.l.l)禾卩月旨肪酵(lipase, triacylglycerol hydrolases, EC 3丄1.3)。羧酸酯酶能够水解或者合成酰基链长度小于10的甘油脂类，以三丁酸 甘油酯(tributyryglycerol)为标准底物，而脂肪酶一般以酰基链长度大于等于10个 碳原子的甘油酯为底物，三油酸甘油酯为其标准底物，不过大多数脂肪酶也能 水解羧酸酯酶的底物。酯酶属于典型的a/p水解酶超家族，具有由Ser, His和Asp 构成的催化中心三组合(catalytic triad),其中Ser通常位于具有保守的 Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly五肽结构内。构成催化中心三组合的三个氨基酸一级结构 相差很远，但是空间结构排列在靠近的位置上，亲核氨基酸Ser残基通过氢键与 His相连，Asp残基也通过由羧基形成的氢键与His相连。酯酶作为一种重要的工业用酶，在全球酶制剂市场上占有很大比例。由于 酯酶基因的表达量和重组酯酶的性质受许多因素的影响(l)酯酶是一类对细胞 有毒性的物质，在异源宿主表达时常会对宿主细胞造成毒性导致细胞的裂解； (2)酯酶蛋白在折叠过程中常需要分子伴侣帮助其折叠成正确的构象；(3)酯酶在 培养过程中常需要诱导物的存在；(4)酯酶基因的非翻译区，酯酶前肽和信号肽 的存在、密码子的差异以及不同表达系统表达重组酯酶的糖基化等都会影响酯 酶基因的异源表达。特别是大肠杆菌，其作为低等的原核生物，缺乏完善的翻 译后修饰系统，酯酶在其中的表达常以包涵体形式存在，极少获得活性蛋白，同时热稳定性酯酶主要来自于嗜热或者超嗜热的环境中，来自中温菌株中的热稳定性酯酶尚未见报道。发明内容本发明所要解决的第l个技术问题是提供一种热稳定性的羧酸酯酶基因。本发明所要解决的第2个技术问题提供是上述基因编码的蛋白质。本发明所要解决的第3个技术问题上述蛋白质的应用。本发明从变铅青链霉菌中获得热稳定性羧酸酯酶新基因^^F，其编码如SEQ IDNO:l所示的氨基酸序列，上述由基因推导出来的氨基酸一级序列分析表明该 基因编码蛋白是true lipases subfamily 1.7中的新成员；将esf『与pET28b质粒连接， 构建重组表达质粒pET28b-e^『；该重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，构建用 于M,达的基因工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-eW『；上述工程菌在低温25 'C和0.5 mM IPTG条件下获得了较好的表达;对羧酸酯酶EstW进行纯化并检测酶 学性质表明，该酶最适反应温度和pH分别为50'C， pH 8.0。 EstW具有极高的热 稳定性，95'C下温育12.5h以后酶活为51.34n/。，随后开始达到半衰期。本发明的酯酶在制备非类固醇消炎药或阿魏酸的生产的应用。本发明与现有技术相比，含有EstW的酯酶为目前从已知中温菌株中的链霉 菌获取的热稳定性的酯酶，可广泛应用于非类固醇消炎药或阿魏酸的生产。
图1为eW『基因的PCR扩增图。在图l中Ml为MarkerIII， l为as^^因的PCR扩增产物。 图2为AWe I /屈o I双酶切鉴定重组质粒pET28b-eW『的PCR扩增图。 在图2中M2为1 kb DNA Marker; 2为pET28b-eW『经A/^e I /屈o I双 酶切产物。图3 SDS-PAGE分析EstW的表结果示意图。在图3中M3为蛋白质Marker; 31为携带有pET28b质粒的粗酶液；32为携带有pET28b-e^『质粒的未经IPTG诱导的粗酶液；33为带有pET28b-eW『质粒 的0.5mMIPTG诱导的粗酶液；34为EstW的纯化蛋白图4为EstW的酶活与温度的关系图。图5为EstW的酶活与pH值的关系。在图5中，國为Na-citrate缓冲液(pH 5.5-7.0); *为Tris—HC1 (7.0—9.0) 缓冲液；A为KH2P04-NaOH(8.5-9.5)缓冲液。.图6为在95'C条件下，EstW的残余酶活与时间的关系。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细的说明。 实施例1:1、 羧酸酯酶基因ew『获得培养变铅青链霉菌TK64并提取基因组，以其基因组DNA为模板，以eW『-F: ATACGTCCATATGAGTTTCCTCAATCCCCGCAT 和 e,画R : TAACTCGAGCGATTATAAAGCTTCCCG (下划线分别为AWeI和Wol酶切位 点)为引物，在98 。C， 10 s， 55 。C， 10 s， 72 。C, 1 min 10 s， 35个循环的条件下进 行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳(图l)，随后，扩增产物与载体pET28b(+) 分别经iV&I、屈ol双酶切后，连接，转化大肠杆菌DH5a、卡那霉素抗性筛选 阳性克隆，获得表达质粒pET28b-eW『，双酶切鉴定(图2);将表达质粒 pET28b-e^『进行测序，氨基酸序列如SEQ ID NO:l所示。2、 表达工程菌构建将表达质粒pET28b-eW『按照现有技术转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态 细胞，卡那霉素和氯霉素筛选阳性克隆，构建重组工程菌Rosetta(DE3) /pET28b-es氛3、 EstW的表达和纯化挑取重组工程菌Rosetta(DE3) /pET28b-W『于含5 ml LB液体培养基的试管中，37 °C， 225rpm，过夜扩大培养；将培养物以1:100接种于LB液体培养基的 锥心瓶中，37°C， 225rpm，振荡培养至OD6。o为0.4-0.6时；加入0.5 mM异丙基硫 代半乳糖苷(isopropyl-(3-D-thiogalactopyranoside， IPTG)， 25TH秀导表达10 h; 4 °C， 5,000 rpm，离心5 min，收集菌体，超声波破碎。用Cc^+离子亲和柱(TALON purification Kit)纯化。纯化后的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定 (图3)，如图3所示在分子量33kDa处有一特异性很高的条带，说明纯化后的蛋 白纯度较高，SDS-PAGE显示EstW的大小约为33kDa,与通过氨基酸序列计算的 带有6个His-tag的EstW分子量大小(32.4 kDa)相一致。 4、序列分析利用BioEdit分析eW瞎因序列，该基因全长870bp，起始密码子为GTG，终 止密码子为TGA， 0(:含量为68.39%,体现了链霉菌基因组的高GC含量特征。利 用ClustalX1.8和Megalign6丄分析不同家族羧酸酯酶/脂肪酶序列，表明该羧 酸酯酶属于true lipases subfamily 1.7家族成员。EstW —级结构具有 Glyl37-Phel38-Serl39-Glul40-Gly141五肽保守区，符合酯酶保守的 Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly五肽结构，三级结构含有Ser139 - Asp235 - His270催化三亚 基，Serl39作为亲核基团与Asp235、 His270通过氢键相连。实施例2:EstW最适温度检测EstW的酶活检测标准体系lml， 50mMTris-HCL(pH8.0)， 1%乙腈，0.5 mM 的对硝基苯酚已酸酯，5pl纯酶液，使用可以自动控温的Cary300UV分光光度 计，检测波长为410nm。设置反应温度(1(TC-6(TC)，试验独立重复3次，取平均 值，结果表明该酶的最适温度是5(TC (图4)。实施例3:EstW最适pH检测采用标准的测定体系，反应温度为5(TC，在相应的pH范围使用相应的缓冲液，pH 5.0 to 7.04, 50 mM sodium citrate buffer; pH 7.0-9.0, 50 mM Tris,HCl buffer; pH 8.5-9.0, 50 mM K2HP04-KOH buffer。检测波长为00348，试验独立重复3次， 结果显示该酶的最适pH是8.0 (图5)。 实施例6:EstW热稳定性检测将EstW纯酶在20°C- 95'C范围间不同温度温育一定时间，采用标准检测体系， 50'C检测残余酶活，确定热稳定性，以未处理的纯酶活性设为100%。结果表明， 该酶在5(TC和卯t:条件下分别放置173 h和13.7 h，酶活性无明显变化。95°C 下EstW放置6.7 h，酶活仍在90%以上，12.5 h以后逐渐达到半衰期(图6)。 EstW 是目前已知的来自链霉菌中热稳定性最高的酯酶，也是该酶所属true lipases subfamily 1.7家族中热稳定性最高的酶。该酶甚至较许多来自嗜热环境的酯酶， 如来自 T7zer附o/ /w7/c 5ac/〃ws sp.禾卩77 erwoawaera6acfer tewgcowge"s/s的月旨肪酶 及来自^^^og/oZ^s/M/gW附和嗜热环境宏基因组文库中的羧酸酯酶热稳定性 都高。序列表<110>安徽师范大学<120> —种热稳定性羧酸酯酶基因、编码蛋白及其应用 <130> 1 <160> 1< 170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 289 <212> PRT<213> 变铅青链霉菌(streptomyces lividands) <400> 1Val Ser Phe Leu Asn Pro Arg lie Pro Gly Val Asn Ser Asp Asp Val 1 5 10 15Val Thr Asp lie Thr Glu Ala Pro His Arg Leu Gly Ala Val Val Gin20 25 30Ala Gly Gly Ala Gin Val lie Ala Thr Val Asp Val Gin Ala Gly Glu 35 40 45Asp Asp Tip Asn Thr Pro Pro Ser Glu Glu His Pro Arg Pro Val Val50 55 60Leu Val His Gly Thr Phe Gly Asn Arg Gly Tyr Thr Tip Asn Thr Ala 65 70 75 80Val Pro Leu Leu Arg Arg His Gly His Arg Val Phe Arg Leu Asp Tyr85 卯 95Val Pro Leu Leu Arg Arg His Gly His Arg Val Phe Arg Leu Asp Tyr 85 90 956dsyS8乙 08Z SZXbiv nsi可v s人i ti9i iBA ni￡> usy nsi ib八usy j人工ojj ppmOZX S9Z 09乙J9S IBA s!h 。w iq丄s!h dsy dsV 0Jd dsy qi dsy ui￡> p八qi "乙usv usv PA W丄sX3 yCi￡) W丄s乂i可v ns^可v iq丄W工se乙 ok0Jd JilL PA PA dsy dsy "丄WD oq丄biv叩ib八JiU s!h i它八ok siz oi乙々O WO Jq丄巧工nio々{) t\9i dsy biv ni￡> Sjy uio 9iy nsq s旧SO乙 00Z S6Idsy s!h WO mi WD cxy di工biv ojj p八ib八WO ib八061 SSI 081uIO ni￡) nsi ni￡> ib八biv勺o ojj叩iqo 可v n3l usv "I 0/J S9Imi々9 uid biv iq丄ib八々o s!h usv 叩々o ib八叫d091 "I 0"usv s!H I它A sXq ojd人io ^0 nsi usy nsi jX丄jX丄§oy 0Jds￡i 0U pjA[々￡)々￡> uio 叫d iba ti3i dsy f八xqo ui{)可y々￡)hi on巧工3"TV nsi iB八nio dsy卩a siy dsv biv n9l ui￡) §JV可v J9S Oil SOI 001s!H an dsy AO 々{) sqd叩ojd usy s!H WO ^
权利要求
1、一种热稳定性羧酸酯酶，其特征在于它具有SEQ ID NO1，所示的氨基酸序列。
2、 一种编码权利要求1所述的热稳定性羧酸酯酶的基因。
3、 权利要求1所述的热稳定性羧酸酯酶在制备非类固醇消炎药或阿魏酸 的生产的应用。
全文摘要
本发明公开了一种热稳定性羧酸酯酶基因、编码蛋白及其应用，所述的酯酶具有SEQ ID NO1，所示的氨基酸序列。本发明与现有技术相比，含有EstW的酯酶为目前从已知中温菌株中的链霉菌获取的热稳定性的酯酶，可广泛应用于非类固醇消炎药或阿魏酸的生产。
文档编号C12N9/18GK101603037SQ20091014421
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月23日 优先权日2009年7月23日
发明者平 宋, 曹正宇, 朱国萍, 鹏 王, 王宝娟, 苏蕊蕊, 葛亚东, 陈露露 申请人:安徽师范大学