二化螟羧酸酯酶及其编码基因、制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种二化螟羧酸酯酶和编码二化螟羧酸酯酶的基因，以及二化螟羧酸酯酶的制备方法和应用。该二化螟羧酸酯酶氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，二化螟羧酸酯酶基因如SEQ?ID?No.1所示，本发明从二化螟4龄幼虫中克隆到二化螟羧酸酯酶基因，再通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统快速产生重组病毒，并在昆虫细胞中成功获得高表达量和高活性的二化螟羧酸酯酶。本发明所述二化螟羧酸酯酶不仅可应用于农药的检测，还可应用于农药的降解，解决了目前昆虫乙酰胆碱酯酶种类缺乏的问题，提供了一种新的农药检测途径。
【专利说明】二化螟羧酸酯酶及其编码基因、制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因生物工程领域，具体涉及一种二化螟羧酸酯酶及其编码基因、制 备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 农药是人类主动大量投放到环境中的一类具有生物毒性的化学物质。目前，我国 农药过量使用的问题十分严重，大量施用的农药仅约1 %能发挥药效，其余大多残留于土 壤、飘浮于大气中或通过径流进入水域，严重危害生态环境和人类食品安全，进而损害人类 健康。我国农产品的农药残留污染十分普遍且相当严重，而且我国人群因农药及其残留污 染而引起的急慢性中毒现象较为普遍。此外，长期大量使用化学农药还会导致害虫产生抗 药性，使得防效降低或丧失。害虫抗药性的产生导致用药量和防治成本增加，并趋向于更高 毒性农药使用，进而又加重环境污染，呈现恶性循环。害虫抗药性的形成还使得农药使用期 限大为缩减，这对新农药创制提出了更高的要求。尽管因不合理使用农药而引发一系列的 生态环境和人类健康等问题，但鉴于有害生物易爆发成灾的特点，化学农药在当前乃至今 后的应急防治体系中仍将占据中心地位。所以，加强农药污染监测和控制是全世界各国关 注的重点问题。
[0003] 目前，常用的农药残留检测方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法 和快速检测法如胆碱酯酶抑制法及其基础上发展形成的酶生物感应器等。薄层色谱准确度 不高；气相色谱和液相色谱灵敏度好，准确度高，但需要的仪器设备投入大，操作复杂，检测 成本高，也不便于现场检测。以昆虫乙酰胆碱酯酶为基础的快速检测法已应用于农药的残 留检测中，昆虫乙酰胆碱酯酶是一种催化乙酰胆碱分解的水解酶，具有能被〇Ps和CBs类农 药强烈抑制的特性。乙酰胆碱酯酶通过与〇Ps和CBs类农药结合，来检测农药的残留量，但 是该类检测手段常会受到乙酰胆碱酯酶种类缺乏、以及灵敏度、选择性和稳定性问题的影 响，最终造成商业化应用受到限制。因此，如何能够找到稳定、高质量的酶源解决是上述问 题的关键。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种高表达量和高活性的二化螟羧酸酯酶。
[0005] -种二化螟羧酸酯酶，具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
[0006] 本发明还提供了一种编码所述二化螟羧酸酯酶的基因。
[0007] 优选的，所述的基因的碱基序列如SEQ ID No. 1所示。
[0008] 本发明还提供了 一种包含所述基因的重组载体和转化子。
[0009] 本发明又提供了一种所述二化螟羧酸酯酶的制备方法，包括：
[0010] (1)将二化螟羧酸酯酶基因亚克隆到转移载体的多克隆位点中，获得重组转移载 体；
[0011] (2)将重组转移载体转化到大肠杆菌DHlOBac感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取 重组杆状病毒穿梭载体；
[0012] (3)用重组杆状病毒穿梭载体转染宿主细胞，培养宿主细胞，并分离获得重组杆状 病毒；
[0013] (4)将重组杆状病毒感染昆虫细胞，并培养转染后的昆虫细胞，分离、纯化二化螟 羧酸酯酶。
[0014] 所述转移载体为pFastBac-HTB。该供体质粒含有mini_Tn7转座子可在大肠杆菌 DHlOBac中将该质粒中含有二化螟羧酸酯酶基因的表达框移至杆状病毒穿梭载体Bacmid 中，实现大肠杆菌内重组病毒的构建。
[0015] 所述宿主细胞为昆虫Τη细胞、Sf细胞和Bm细胞中的一种。
[0016] 本发明还提供了所述二化螟羧酸酯酶在农药检测或降解上的应用。
[0017] 具体的，所述农药为有机磷、氨基甲酸酯或拟除虫菊酯杀虫剂。
[0018] 具体的，所述农药为氯氰菊酯。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0020] 本发明从二化螟4龄幼虫中克隆到二化螟羧酸酯酶基因，再通过Bac-to-Bac杆状 病毒表达系统快速产生重组病毒，并在昆虫细胞中成功获得高表达量和高活性的二化螟羧 酸酯酶。
[0021] 本发明所述二化螟羧酸酯酶不仅可应用于农药的检测，还可应用于农药的降解， 解决了目前昆虫乙酰胆碱酯酶种类缺乏的问题，提供了一种新的农药检测途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1是重组转移载体PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；
[0023] 图2是纯化后二化螟羧酸酯酶的SDS-PAGE电泳图和Western印迹图。
【具体实施方式】
[0024] 本发明中的杆状病毒转移载体pFastBac-HTB、大肠杆菌DHlOBac菌株、 CELLFECTIN、昆虫High Five细胞、Sf9细胞、昆虫细胞培养基Sf-900II SFM和Expres s Five SFM 以及 Trizol 试剂均为 Life Technologies(Invitrogen)公司产品。
[0025] 实施例1
[0026] 使用Trizol试剂从二化螟4龄幼虫中提取总RNA，经逆转录酶反应合成cDNA ;设 计含有酶切位点的特异性引物，采用高保真DNA聚合酶，以合成的cDNA为模板扩增获得2 端带有酶切位点的开放阅读框完整的二化螟羧酸酯酶基因，BamHI和Xhol双酶切后，连接 至经相同酶切的转移载体pFastBac-HTB中。
[0027] 引物序列如下：
[0028] F_CsC0E026-BamHI ：5/ -CGGGATCCATGTTCGAATATTTG-3;；
[0029] R_CsC0E026-XhoI :5^ -CCGCTCGAGTTATTTCTTTATTGT-3'。
[0030] 二化螟羧酸酯酶基因 CsC0E026的碱基序列如SEQ ID No. 1所示。
[0031] 将重组转移载体转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，并在含有50 μ g/mL卡那霉 素、7yg/mL庆大霉素、10yg/mL 四环素、100yg/mL X-gal 和 20yg/mL IPTG 的 LB 平板上， 37°C条件下培养24-48h，挑选白色菌落，37°C振荡培养过夜后，抽提获得重组病毒穿梭载体 Bacmid〇
[0032] 将重组病毒穿梭载体Bacmid用于转染Sf9细胞。在6孔组织培养板中接种 2ml9X10 5Sf9 细胞/ 孔，27°C 贴壁 2h。5yL重组Bacmid(约 lyg)和 6yL CELLFECTIN 分 别用SF900II SFM稀释成lOOyL，室温置45min。细胞用2mL SF900II SFM培养基淋洗1 次；转染混合液中补加〇. 8mLSF900II SFM培养基，滴加入含有细胞的培养板孔中，27°C培 育7h，换为2mL含抗生素（100 μ g/mL氨苄青霉素和100 μ g/mL链霉素）的SF900IISFM培 养基，27°C培育72h，收集孔板中含重组杆状病毒的培养液，1000rpm/min离心5min以去除 细胞及较大的碎片，收集上清即得到重组杆状病毒。
[0033] 将重组杆状病毒大量感染High Five细胞，观察到细胞感染迹象时，收集细胞。将 细胞经超声破碎后离心取上清，将上清液利用Ni-NTA柱分离纯化获得相应的蛋白质，并通 过SDS-PAGE以及Western blot分析纯蛋白纯度。结果在67kD处有条带并且纯度达到了 90 %以上，表明了重组二化螟羧酸酯酶表达成功。
[0034] 采用酶标仪，以4-硝基苯基乙酸酯（pNPA，美国Sigma公司）为底物测定羧酸 酯酶活性。测定方法如下：在96孔板的加样孔中依次加入199 μ L0. lmol/L磷酸缓冲液 (ρΗ7· 4)和10 μ L酶液；30°C保温5min后，快速加入1 μ L10mmol/L pNPA，并置于多功能酶 标仪Synergy HT(美国Bio-Tek公司）中，30°C下于405nm处测定15min内的吸光值变化。 反应重复3次。抑制中浓度的测定是将酶液与以不同浓度稀释的杀虫剂液混匀于酶标板加 样孔中，30°C下放置5min，测定羧酸酯酶的剩余活力。
[0035] 计算方法为，以羧酸酯酶活力抑制率的机率值为纵坐标，以杀虫剂浓度对数为横 坐标，得到一条直线并计算求得线性回归方程，取机率值为5求得抑制酶50%活力时的杀 虫剂浓度对数，反对数即得抑制中浓度（1 5〇)。测定结果为有机磷杀虫剂（对氧磷）和氨 基甲酸酯杀虫剂（灭多威）对表达的羧酸酯酶酶液的抑制中浓度各为〇. 11±〇. 01 μ Μ和 37. 29±5. 81μΜ。
[0036] 采用高效液相色谱法检测二化螟羧酸酯酶重组蛋白对氯氰菊酯的活性。测定方 法如下：反应体系总体积100 μ L，反应温度30°C，设置5个反应，分别在反应0min、30min、 60min、90min、120min时依次加入分析纯乙腈，终止各反应的进行，分别将得到的反应液离 心取上清，上样高效液相色谱仪（安捷伦1200series)以测定反应液中残余氯氰菊酯的浓 度。每个反应均重复3次。检测条件：Eclipse XDB-C18(4.6X150mmX5yL)色谱柱，流动 相为乙腈：0.5%冰醋酸，流速1111171^11，检测波长21〇11111，柱温3〇1：，进样量21^。测定结果 为表达的羧酸酯酶对氯氰菊酯的代谢活性为9· 14±1· 27μ mol/min/μ mol。
[0001] _序列 表_ SEQUENCE LISTING <丨丨1>浙江大学 <120>二化螟羧酸酯酶及其编码基因、制备方法和应用 <130> <160> 4 ^170^ Patcntln version 3.3 <210> 1 <211> 1671 <212> DNA <21> 二化螟 <400> 1 atgttcgaat atttgttatt tettatagtt gtatctaatg tgttttgtga agatgtggcc 60 gattccagga ttgtcgaact gccagaaggc gatgtgcaag gcgcaaaata ctggaatggg 120 gatatttatg aattetaegg ggtgccatat gcgactgcgc cgaaggggcg cgacagattt 180 aagccccctc ttccagtcac accaagaaaa actattctaa cagcggacaa acaatcaatt 240 atgtgccatc aaacgtttta cacaggcgaa gatgaagaag aaatattcct gaatggtgaa 300
[0002] gaggactgtc tagtcatgaa cattctcgta cctcttattg caaacaggac gaatttagta 360 ccagtggttg tatacatcca cagcggggca ttcgccggtg gcagtgctaa tatgggcaag 42() cttcattacc tagcaagatt aggtgtagta gccattactt tcaactacag agttggagct 480 gtagggttcg cttgcctagg tacagaagaa attcccggta acgctggtct taaagatcaa 540 ttggctgcat tgaaatggat caaaaagaat attggaagat ttggtggaga ccctgataaa (00 attacgctgg ctggttacag tgttggtgca accatggcag aaatacacgc attatcaaaa (()0 cacaaacaca ctaatggatt gttcgataag ctaattttgg acagtggatc agcattaacc 720 ccttttgcaa tcaacagaca tccaataaca acagcaagga acattgcatt gtcttttggc 780 tacaatattii caggaaatat caaagattta acagagttct atttiiaacgc tacagataca S40 gatctggcaa taaaaagttt aaattttttc ttgcccaata gtacttttgg tttttctcct 900 tgtattgaaa gtatagaaaa taaccctgaa ccttatttga ctgaatcgcc attiigaaact 9( 0 ttgaagagag gagatgtaaa acaattagct attttgattg ggttcacaaa aatggaagga 1020 ctaagtagat ccggtcaatt tggtgcatgg aaaaaaaaga tgaatgaiiaa ctttgctgag 1080 gttttaccag cagatttgat cttcaaagat gacaaaacga aggaagaaat tgccaaaatg 1140 gtgaaacatt attattttaa ggatgatgaa gtaacaaatg ataagaaaaa ggaatacgtt 1200 gattatttta gtgactctat gtttaaatat ccaataataa agtcgctgat gttacaaaga 1260
[0003] gcaatcacaa caagaccgtt ttacgtttat gagttttcat acgttggtga attaagcacg 1320 ccacatcatt ttatggatac tattaaaggt gccactcata gagaccaaga ticgtatatt 1380 tgggatttct atggcttcac aaaaaatcca gaagatatgg acacaagaga tcgcatgaca 1440 tacatgtgga cggattttgt aaagtttgaa aacccgaccg catatgaaag cgacttgata 1500 gatacaaaat ggaaggtata ctcaaggcaa catccctact acctttcgat tgacagaaaa 1560 ctggaattga aggtggaccc ggttcccgaa tcttatcagt tttgggacaa gttgtacgaa 1620 aaatattact gggacccaac acatcagaag ccagacacaa taaagaaata a 1671 <210> 2 <211> 556 <212> PRT <213>二化螟 ，400> 2 Met Phc Cilu Tyr Leu Leu Phe Leu lie Val Val Ser Asn Val Phe Cys 15 10 15 Glu Asp Val Ala Asp Scr Arg lie Val Glu Leu Pro Glu Gly Asp Val 20 25 30 Gin Gly Ala Lys Tyr Tip Asn Gly Asp lie Tyr Glu Phe Tyr Gly Val 35 40 45 Pro Tyr Ala Thr Ala Pro Lys Gly Arg Asp Arg Phe Lys Pro Pro Leu 50 55 60
[0004] Pro Val Thr Pro Arg Lys Thr !lc LeuThr Ala Asp Lys Gin Scr He 65 70 75 80 Met Cys His Gin Thr Phe Tyr Thr Gly Glu Asp Glu GIu Glu lie Phc 85 90 95 Leu Asn Gly Glu Glu Asp Cys Leu Val Met Asn lie Leu Val Pro Leu 100 105 110 lie Ala Asn Arg Thr Asn Leu Val Pro Val Val Val Tyr lie His Ser 115 120 125 GlyAlaPhe Ala Gly Gly Scr Ala Asn Met Gly Lys Leu His Tyr Leu 130 135 140 Ala Arg Leu Gly Val Vd\ Ala lie Thr Phe Asn Tyr Arg Val Giy Ala 145 150 155 160 Val Gly Phc Ala Cys Leu Gly Thr Glu Glu lie Pro Gly Asn Ala Gly 165 170 175 Leu Lys Asp Gin Leu Ala Ala Leu Lys Tip lie Lys Lys Asn Me Gly 180 185 190 Arg Phe Gly Gly Asp Pro Asp Lys Me Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Val 195 200 205 Gly Ala Thr Met Ala Glu lie His Ala Leu Scr Lys His Lys His Thr 210 215 220 Asn Gly Leu Phe Asp Lys Leu lie Leu Asp Scr Gly Scr Ala Leu Thr 225 230 235 240 Pro Phe Ala Me Asn Arg His Pro lie Thr Thr Ala Arg Asn lie Ala 245 250 255 Leu Ser Phc Gly Tyr Asn lie Thr Gly Asn Me Lys Asp Leu Thr Glu 260 265 270 Phe Tyr Leu Asn Ala Thr Asp Thr Asp Leu Ala I le Lys Scr Leu Asn 275 280 285 Phe Phc Leu Pro Asn Ser Thr Phc Gly Phe Scr Pro Cys lie Glu Scr 290 295 300
[0005] lie Glu Asn Asn Pro Glu Pro Tyr Leu Thr Giu Ser Pro Leu Cilu Thr 305 310 315 320 Leu Lys Arg Gly Asp Vai Lys Gin Leu Ala He Leu lie Gly Phe Thr 325 330 335 Lys Met Glu Gly Leu Ser Arg Ser Gly Gin Phe Gly Ala Tip Lys Lys 340 345 350 Lys Met Asn Giu Asn Phe Ala Glu Val Leu Pro Ala Asp Leu lie Phe 355 360 365 Lys Asp Asp Lys Thr Lys Glu Glu lie Ala Lys Met Val Lys His Tyr 370 375 380 Tyr Phe Lys Asp Asp Glu Val Tin* Asn Asp Lys Lys Lys Glu Tyr Val 385 390 395 400 Asp Tyr Phe Scr Asp Scr Met Phe Lys Tyr Pro lie lie Lys Scr Leu 405 410 415 Met Leu Gin Arg Ala lie Thr Thr Arg Pro Phe Tyr Val Tyr Glu F^e 420 425 430 Ser Tyr Val Gly Glu Leu Ser Thr Pro His His Phe Met Asp Thr Me 435 440 445 Lys Gly Ala Thr His Arg Asp Gin Asp Ser Tyr Me Tip Asp Phe Tyr 450 455 460 Gly Phe Thr Lys Asn Pro Glu Asp Met Asp Thr Arg Asp Arg Met Thr 465 470 475 480 Tyr Met Tip Thr Asp Phe Val Lys Phe Glu Asn Pro Thr Ala Tyr Glu 485 490 495 Scr Asp Leu lie Asp Thr Lys Trp Lys Val Tyr Ser Arg Gin His Pro 500 505 510 Tyr Tyr Leu Ser He Asp Arg Lys Leu Glu Leu Lys Val Asp Pro Val 515 520 525 Pro Glu Scr Tyr Gin Phe Trp Asp Lys Leu Tyr Glu Lys Tyr Tyr Trp 530 535 540
[0006] Asp Pro Thr His G!n Lys lJro Asp Thr lie Lys Lys 545 550 555 <210 3 <211〉 23 <212> DNA <213>人:丨:合成序列 <400〉 3 cgggatccat gttcgaatat ttg 23 <210〉 4 <211〉 24 <212〉DNA <213>人工合成序列 <400〉 4 ccectceaet tatttcttta ttixt 24
【权利要求】
1. 一种二化螟羧酸酯酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2. -种编码权利要求1所述二化螟羧酸酯酶的基因。
3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，碱基序列如SEQ ID No. 1所示。
4. 一种包含权利要求2或3所述基因的重组载体或转化子。
5. -种如权利要求1所述二化螟羧酸酯酶的制备方法，其特征在于，包括： (1) 将二化螟羧酸酯酶基因克隆到转移载体的多克隆位点中，获得重组转移载体； (2) 将重组转移载体转化到大肠杆菌DHlOBac感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取重组 杆状病毒穿梭载体； (3) 用重组杆状病毒穿梭载体转染宿主细胞，培养后分离获得重组杆状病毒； (4) 将重组杆状病毒感染昆虫细胞，培养后分离得到二化螟羧酸酯酶。
6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述转移载体为pFastBac-HTB。
7. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为昆虫Τη细胞、Sf细胞 或Bm细胞。
8. 如权利要求1所述二化螟羧酸酯酶在农药残留检测或降解中的应用。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述农药为有机磷、氨基甲酸酯或拟除虫菊 醋杀虫剂。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述农药为氯氰菊酯。
【文档编号】C12N9/18GK104087566SQ201410314237
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月3日
【发明者】姚洪渭, 巨青松, 叶恭银 申请人:浙江大学