专利名称：筛选靶向结核杆菌细胞壁核心合成与组装的药物的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选靶向结核杆菌的药物的方法，特别是一种筛选靶向结核杆菌 细胞壁核心合成与组装的药物的方法，以及用于筛选靶向结核杆菌细胞壁核心合成与组装 的药物的筛选模型。具体而言，本发明涉及以谷氨酸棒杆菌为检定菌，以BHI (brain-heart infusion,脑心浸液)培养基和BHIS培养基为筛选介质，从微生物代谢产物及其他来源的 样品中筛选作用于结核杆菌细胞壁核心的合成与组装过程中不同酶系、不同靶点的新型抗 结核药物和先导化合物。本发明还涉及所述筛选模型的筛选方法以及筛选标准。
背景技术：
结核杆菌的细胞壁对于其生长繁殖至关重要，细胞壁各成分的合成与组装过程中 有众多的酶系参与[1]，潜在着多个抗结核药物的新靶点，而且其中多数的酶是人体内所不 存在的，因此靶向结核杆菌细胞壁的药物具有较好的选择毒性。研究表明当参与细胞壁合成与组装受阻，细胞壁因此而变薄或者缺失，导致 菌体渗透压的失衡，对结核分枝杆菌(Mycobacterium, tuberculosis)和耻垢分枝杆菌 (M. smegmatis)的表现为死亡；对于谷氨酸棒杆菌则表现为生长缓慢；该效应可通过在培 养基中增加山梨醇(一种渗透压维持剂)得以补偿，使之生长速度恢复并维持细胞形态[2]。 例如，AftB作为阿拉伯糖层连接最后一个阿拉伯糖的酶，它的缺失会导致分枝菌酸层的缺 失和生长速度的变慢，当培养基中添加山梨醇后，其生长速度几乎可以完全被回复[3]。但现有技术中还缺少筛选靶向结核杆菌全细胞壁的药物的方法，特别是筛选靶向 结核杆菌细胞壁核心合成与组装的药物的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种筛选靶向结核杆菌的药物的方法，更具体而 言涉及一种筛选靶向结核杆菌细胞壁的药物的方法。本发明还涉及一种用于筛选靶向结核杆菌细胞壁的药物的模型。基于谷氨酸棒杆 菌野生株细胞壁发生缺失导致的生长速度变慢，可以由在培养基中添加渗透压维持剂，如 山梨醇，加以补偿的效应，我们成功的构建了一个细胞水平的高通量筛选模型，经过筛选， 得到了一些活性物质，并通过分枝菌酸甲基酯分析，确证了这些活性物质的作用靶点在细 胞壁上。对于上文所述的渗透压维持剂，通常使用蔗糖、山梨醇以及无机盐粒子，如钠盐、 钾盐、钙盐等。在一个具体的实施方式中，本发明使用山梨醇作为渗透压维持剂。在一个具体的实施方式中，本发明的筛选方法可以包括分别在有和无山梨醇存在 的情况下，将检定菌，例如野生型谷氨酸棒杆菌和候选化合物接触，并测定对所述细菌的抑 制。其中所述的抑制，例如是对上述菌株的生长、繁殖的速度的抑制。其中选择在有山梨醇 情况下，不抑制检定菌，而在无山梨醇情况下抑制检定菌的候选化合物。在一个具体的实施方式中，所述方法还可以包括阳性对照实验，其中使用的阳性
3对照化合物例如是乙胺丁醇。 在一个具体的实施方式中，将检定菌在含有渗透压维持剂，例如山梨醇和不含补 偿化合物的培养基中与候选化合物或阳性对照化合物共培养，并测定检定菌的生长、繁殖 的速度，从而测定对检定菌的抑制。 在一个具体的实施方式中，本发明的筛选方法还可以包括筛选后的候选化合物对 草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌或结核分枝杆菌的生长抑制的验证实验。在一个具体的实施方式中，本发明的筛选方法还可以包括筛选后的候选化合物野 生型谷氨酸棒杆菌进行细胞壁成分分析，如分枝菌酸甲基酯分析。在一个具体的实施方式中，首先，本发明的筛选方法可以包括在多孔板上进行检 定菌与候选化合物或阳性对照化合物共培养，其中使用的培养基可以是BHI和BHIS培养 基，通过测定544nm处的吸光度来测定检定菌的生长。其中优选的多孔板是96孔板。其中所述96孔板法中，使用BHI和BHIS培养基，乙胺丁醇的浓度为1 μ g/ml，在 37°C，培养12h后，用酶标仪测定544nm处的吸收，按照如下公式分别计算抑制率， 抑制率差为将BHI培养基中的抑制率减去BHIS培养集中的抑制率作为抑制率差 表示活性差异，其中抑制率差大于10%的待筛样品为阳性药物。在另一个具体的实施方式中，本发明的筛选方法可以包括使用纸片法，在纸片上 进行检定菌与候选化合物或阳性对照化合物共培养，其中使用的培养基是固体培养基，通 过测定抑菌圈的大小来测定检定菌的生长。其中优选的固体培养基可以是BHI和BHIS培 养基添加琼脂粉。其中所述纸片法中，使用所述固体培养基，乙胺丁醇的浓度为100yg/ml，在 37°C，培养16h后，将BHI的抑菌圈直径减去BHIS的抑菌圈直径作为抑菌圈直径差，再将这 个直径差除以BHI培养基中的抑菌圈直径得到比值，对所得的比值进行评价，其中比值大 于12%的待筛样品为阳性药物。96孔板法中，当乙胺丁醇的抑制率差大于50%;纸片法中，当乙胺丁醇的抑菌圈直 径的差大于9mm，认为筛选结果可信。在另一个具体的实施方式中，本发明的筛选方法包括先用96孔板法筛选，再使用 纸片法验证阳性药物。本发明的筛选方法中，分别将谷氨酸棒杆菌(野生型)培养在含候选化合物的培 养基中，所述培养基优选是BHI和BHIS培养基或其相应固体培养基。在另一方面，本发明还涉及谷氨酸棒杆菌(野生型)用于筛选靶向结核杆菌的药 物的用途。更具体而言，本发明涉及谷氨酸棒杆菌(野生型)用于筛选靶向结核杆菌细胞 壁核心合成与组装的药物。1材料和方法1. 1 菌株1.检定用菌株为野生型谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032 购自中国工业微生物菌种保藏中心，以下称为野生型谷氨酸棒杆菌(C. glutamicum)。
2.谷氨酸棒杆菌DAftB(分枝菌酸层缺失突变株，生长速度略低于野生株)由 L. Eggeling教授惠赠。该菌株是通过使用自杀质粒pkltoobsacB，进行基因删除从而缺失 aftB基因而制备的，制备方法可查阅所附参考文献[3]。1. 2培养基BHI (brain-heart infusion,脑心浸液)培养基脑心浸液37g，蒸馏水1L，过滤灭菌。BHIS培养基脑心浸液37g，山梨醇109. 2g，MgSO4 0. 5g，NaCl 10g，蒸馏水1L，过滤灭菌。固体培养基在如上液体培养基(BHI或BHIS)的基础上添加15g琼脂粉，121 °C， 15min灭菌。1.3生化试剂和药品山梨醇(Amresco)，脑心浸液(Difco)。左氧氟沙星，万古霉素，链霉素，乙胺丁醇， 利福平，放线菌素D，林可霉素，四环素，D-环丝氨酸购自中国药品生物制品检定所。1.4模型的建立1. 4. 1培养条件的确定1. 4. 1. 1种子的培养野生型谷氨酸棒杆菌接种固体斜面，37°C，培养12h，然后转接到BHI液体培养基 中，37 °C过夜培养12h。1. 4. 1. 2接种量的确定将种子液稀释至0D_ = 3，在BHI液体培养基中测定不同接菌量(0. 3%，0. 5%， 1%,5%)、不同培养时间(8h，10h, 12h，14h，24h)下的菌体的生长速度和最终的浓度，用OD 来衡量。选择时间合理、灵敏度高和初始条件下与空白对照差异小的接种浓度作为进一步 实验的接种量。1. 4. 1. 3阳性对照药物浓度的确定在BHI和BHIS培养基中，测定不同浓度的乙胺丁醇(lng、10ng、lOOng、1 μ gl、 10ygU00yglUmg/ml)对谷氨酸棒杆菌的生长抑制率，确定二者间差异最大的乙胺丁醇 浓度为筛选模型中的阳性对照药物的浓度。1.4. 2筛选条件的确定基于96孔板法将野生型谷氨酸棒杆菌按照0. 3%的接种量分别接种在BHI和 BHIS两种培养基，每板设置4孔空白对照，4孔正常生长组，4孔阴性对照，4孔阳性对照，80 孔样品组在96孔板上按照如下反应体系加样，反应体系总体积为200 μ 1，体系组成如下 37°C，培养12h后，用酶标仪测定544nm处的吸收，按照如下公式分别计算抑制率。 抑制率差为将BHI培养基中的抑制率减去BHIS培养基中的抑制率。再利用乙胺丁醇作为 实验可信的衡量。 基于纸片法固体培养基，按照0. 3%的接种量，接种于150ml培养基，倒25 X 20cm 的平板。取7mm纸片，每片加上50 μ 1待测样品，每板100个样品，同时每块培养基上贴有 阳性对照和阴性对照。37°C，培养16h后，测定抑菌圈大小，将BHI的抑菌圈直径减去BHIS 的抑菌圈直径记为抑菌圈直径差，再将该直径差除以BHI中的抑菌圈直径得到比值，对得 到的比值进行评价，重复验证。阳性标准的控制，96孔板法中，当阳性药物乙胺丁醇的抑制率差大于50%，；纸片 法中，当阳性药物乙胺丁醇的抑菌圈直径差大于9mm，结果才可信。96孔板法中，当阳性药 物乙胺丁醇的抑制率差大于50%，所得阳性结果再使用纸片法验证。1.5模型的可行性验证应用以上所确定的条件，测定不同作用机制的抗菌药物对检定菌株野生型谷氨酸 棒杆菌在BHI和BHIS两种培养基上的不同作用。每孔加入待测已知抗生素，终浓度1 μ g/ m。由此可确定其作为用于筛选以细胞壁核心为靶点的抗结核药物模型的阳性标准和可行 性。1.6模型的应用1.6. 1化合物的筛选对化合物库的化合物，经过两步稀释，由lmg/ml稀释至10 μ g/ml，使用96孔板筛 选，终浓度为lyg/ml。然后再使用耻垢分枝杆菌对选择的化合物进行纸片法验证。1. 6. 2模型筛选结果的分枝菌酸甲基脂分析1. 6. 2. 1菌体的培养和收集将野生型谷氨酸棒杆菌分别接种于阴性对照管(含5ml BHIS)；样品管(5ml BHIS 中含有相应浓度阳性化合物)；阳性管(5ml BHIS中含有一定浓度乙胺丁醇)培养8h，然后 转接到50ml BHIS中培养15h，再转接到IOOml的BHIS中，每隔半小时取样检测，在从0D_ 为1到OD600为3时取下[4]。检查无污染后，离心(4°C,10000r/min, IOmin)收集菌体，用蒸馏水洗涤2-3次。真空冷冻干燥后放干燥器中备用。1. 6. 2. 2分枝菌酸甲基脂的提取全细胞分枝菌酸甲基脂分析，按照《放线菌系统学_原理方法及实践》提供的方法 进行提取、层析和显色测定[5]。2模型的构建下表显示的是基于96孔板筛选，其中加入待筛样品后可能出现的三种结果，其中 出现第三种情况的样品有可能作用于与渗透压稳定相关蛋白，再经过分枝菌酸分析，可确 定其是否作用于细胞壁。表1筛选中可能出现的情况
组别BHI培养基BHIS培养基可能的结果
Γ I正常的生长速率 正常的生长速率没有抑制作用
II生长变慢生长变慢靶向其他部分
III_生长变慢_正常的生长速率靶向渗透相关蛋白在初筛中，符合编号II的样品，有可能是作用于细胞壁的化合物，但作用效果很 强，山梨醇无法补偿，因此，需要对样品进行适当稀释后再进行测定，测定结果符合第三种 情况的样品即阳性，否则视为阴性。3 讨论本实验采用野生型谷氨酸棒杆菌为检定菌，以不同的培养基为筛选介质，建立靶 向结核杆菌细胞壁核心的合成与组装的筛选模型，从微生物代谢产物及其他来源的样品中 筛选作用于结核杆菌细胞壁核心的合成与组装过程中不同酶系、不同靶点的新型抗结核药 物和先导化合物。由于谷氨酸棒杆菌不能完全替代结核杆菌，前者对各类抗生素较敏感，所以由该 模型筛选得到的阳性样品还要经过草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌或结核分枝杆菌的验证才能 确定其作用，选择谷氨酸棒杆菌作为鉴定菌是因为它的生长周期短，后期机理研究中突变 株构建方便等优势。该模型优势在于1.可以筛选到靶向结核杆菌细胞壁核心的合成与装配全过程 的抗结核药物，既包括作用于结核杆菌细胞壁核心合成途径的药物，也涵盖了作用于结核 杆菌细胞壁各单元部分的装配过程的关键酶抑制剂，同时可以筛选到参与以上过程但目 前尚不明确的关键酶抑制剂；2.采用细胞水平模型筛选，样品直接作用于细胞，避免了通 过分子或是蛋白水平等体外模型筛选得到的活性物质，因不能进入细胞而导致的假阳性； 3.该模型操作简便，通量高，以谷氨酸棒杆菌作为替代菌避免了结核杆菌生长缓慢和致病 性带来的难题，加快了筛选速度。
图1野生型谷氨酸棒杆菌在BHI培养基中的生长曲线使用酶标仪检测544nm处的紫外吸收。不同接种量的生长曲线的图示，5% (■)， 1% (A),0.5% (Δ),0.3% ( ),0. 1% ( )，空白培养基(〇)。
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图2野生型谷氨酸棒杆菌的全细胞分枝菌酸甲基脂的TLC模式样品分别提取自1，无处理野生型谷氨酸棒杆菌；2，无处理谷氨酸棒杆菌Δ Af tB 突变株；3，乙胺丁醇处理处理野生型谷氨酸棒杆菌组；4，化合物2008551处理野生型谷氨 酸棒杆菌；5，化合物2009461处理野生型谷氨酸棒杆菌。斑点Α，α枝菌酸酮，Rf = 0. 6 ； B，酮基枝菌酸酯，Rf = 0. 45.
具体实施例方式实施例1接种量的确定野生型谷氨酸棒杆菌种子在37°C，培养12h后，0D_值可达6. 6-7. 5，稀释至0D_ 为3。以不同比例的接种量(5%、1%、0. 5%、0. 3%和0/1%)，不同培养时间(8h，10h，12h， 14h，24h)下的菌体的生长速度和最终的浓度，用OD来衡量，接种后的生长曲线如图1。选 择培养前吸收值差别较小的几个接种浓度，使用1 μ g/ml的乙胺丁醇对其评价，接菌量为 0. 3%时的抑制率差最为明显为56. 5士5. 71，而在0. 5%的接菌量时为37. 4士4. 22，在 的接菌量时为17. 2士 1. 37，且在0. 3%的接菌量时乙胺丁醇对于BHI培养基中菌体的抑制 情况最为显著。实施例2阳性对照药物浓度的确定在BHI和BHIS培养基中，测定不同浓度乙胺丁醇(lng，10ng，lOOng，1 μ gl，10 μ g， 100ygl,lmg/ml)对野生型谷氨酸棒杆菌的生长抑制率，确定二者间差异最大的乙胺丁醇 浓度为筛选模型中的阳性对照药物的浓度。乙胺丁醇浓度的确定，1 μ g/ml的浓度对两种培养基中野生型谷氨酸棒杆菌的抑 制率差别较明显，而使用10yg/ml的浓度时，在BHIS培养基中，山梨醇不能很明显的恢复 谷氨酸棒杆菌的生长。因此选择1 μ g/ml作为基于96孔板的药物筛选模型的构建和应用 的衡量标准。实施例3模型的可行性验证应用以上所确定的条件，测定不同作用机制的抗生素对检定菌株野生型谷氨酸棒 杆菌在两种培养基上的不同作用。对于96孔板法，每孔加入待测已知抗生素，终浓度为 1 μ g/ml。对于纸片法，在直径为7_的纸片上，加上50 μ 1，100 μ g/ml的化合物。表2不同作用机制的抗生素对野生型谷氨酸棒杆菌在不同培养基上的抑制情况 a.使用浓度为50ug/ml ；b.使用浓度为500ug/ml基于96孔板的筛选中，活性差异使用抑制率差表示。由表2可以看出，已知作用 于结核杆菌细胞壁的药品中，乙胺丁醇、D-环丝氨酸效果都很明显。同时万古霉素作用位 点众多，在本发明的模型上表现为阴性；链霉素和四环素作用于核糖体30S亚基，林可霉素 作用于50S亚基，因此都表现为阴性；左氧氟沙星作用于DNA回旋酶A亚基，利福平作用于 RNA合成的起始，放线菌素D作用于DNA的复制，因此也都表现为阴性。由此，我们确定了模 型的阳性标准，基于96孔板法10%的抑制率差作为分界；基于纸片法，比值大于12%时为 阳性。此结果也明确地说明了该模型的准确性。实施例4模型的应用使用该模型对化合物库的3043个化合物和3182个发酵液样品进行如上方法的筛 选，得到阳性化合物14个，阳性发酵液样品34个，阳性率分别为约0. 5%和0. 9%。为了 确证样品和细胞壁之间的相互作用，我们使用了一个简便的分枝菌酸甲基酯分析的办法确 证。分枝菌酸层为细胞壁的最外层，最易于表现细胞壁缺失情况，选择其中的两个化 合物(化合物2008551和化合物2009461)进行了细胞壁分枝菌酸的分析，并与无处理野生 菌株、乙胺丁醇处理野生型谷氨酸棒杆菌处理组和无处理AftB突变株(缺失分枝菌酸)作 比较。如图2所示，各组均与野生菌株有差异，可以看出其细胞壁的分枝菌酸发生变化，进 一步证明该模型的可行性。实施例5最低抑菌浓度(MIC)的测定活性化合物进一步进行最低抑菌浓度(MIC)的测定，培养耻垢分枝杆菌于54#培 养基斜面37°C，培养4天；然后接种于20ml液体54#培养基，37°C，200r. p. m.摇床培养2 天。96孔板上，将菌体稀释至终浓度为每孔5X105个，终体积为每孔100 μ 1。边缘空使用 200 μ 1/孔无菌水补齐。于37°C培养48h后，使用酶标仪读取544nm处的吸收值，结果中细 胞密度数值小于0. 020D视为最小抑菌浓度。测定结果化合物2009461和乙胺丁醇对于耻垢分支杆菌的MIC，分别为0. 4 μ g/ml 禾口 0· 8 μ g/ml。实施例6筛选后的化合物对结核分枝杆菌的生长抑制
使用96孔板，200 μ 1体系，7Η9培养基，结核分枝杆菌标准株H37Rv浓度IO6CFU/ ml，药物的初浓度32μ g/ml，二倍稀释。37°C孵育7天，加入20 μ 1 IOXAlamar blue和 50 μ 1 5%Tween80的混合液，37°C再孵育24小时后，应用多功能酶标仪测定，定量得到MIC 数据。对候选化合物2009461的测试结果，其MIC为2 μ g/ml,乙胺丁醇对照为0. 5 μ g/ ml ο参考文献[IjBarryl CE, Crick DC, McNeil MR, et al. Targeting theFormation of the Cell Wall Core of M. t uberculosis[J]. InfectDisord Drug Targets,2007,7 (2) 182-202.[2]D J. Frost, Kim D.Brandt,D Cugier,et al. Awhole-cell Candida albicans assay for the detection ofinhibitors towards fungal cell wall synthesis and ass 乙胺丁醇 Iy[J]. J Antibiot(Tokyo)，1995，(48)4:306-310[3] Seidel Μ, Alderwick LJ, Birch HL, et al. Identificat ion of a novel arabinofuranosyl transferase AftBinvolved in a terminal step of cell wall a rabinan biosynthesisin Corynebacterianeae, such as Corynebacterium glutamicum andMycobacterium tuberculosis[J]. J Bio Chem，2007，282(20) :14729_14740[4]Kaur D,Brennan PJ,Crick DC,et al. Decaprenyldiphosphate synthesis in Mycobacterium tuberculosis[J]. JBacteriol,2004,186(22) :7564_7570[5]徐丽华等主编。放线菌系统学-原理.方法及实践[M]，科学出版社，2007[6]Ying Zhang, L. Mario Amzel. Tuberculosis Drugtargets[J]. Curr Drug Targets,2002, 3(2) :131_15权利要求
一种筛选靶向结核杆菌的药物的方法，其包括在无渗透压维持剂，例如山梨醇存在的情况下，将检定菌，例如野生型谷氨酸棒杆菌和候选化合物接触，并测定对所述细菌的抑制，所述抑制包括对鉴定菌的生长、繁殖的速度的抑制。
2.权利要求1的方法，其还包括在有渗透压维持剂，例如山梨醇存在的情况下，将检定 菌，例如野生型谷氨酸棒杆菌和候选化合物接触，并测定对所述细菌的抑制。
3.权利要求1或2的方法，其中选择在有渗透压维持剂情况下，不抑制检定菌，而在无 渗透压维持剂情况下抑制检定菌的候选化合物。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其用于筛选靶向结核杆菌细胞壁核心合成与组装的 药物。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其还包括阳性对照实验，其中使用的阳性对照化合 物例如是乙胺丁醇。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其还包括耻垢分枝杆菌验证。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其还包括细胞壁成分分析，如分枝菌酸分析甲基酯 分析。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其还包括筛选后的候选化合物对草分枝杆菌、耻垢 分枝杆菌或结核分枝杆菌的生长抑制的验证实验。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中采用多孔板法或纸片法测定所述细菌的抑制。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其包括分别将谷氨酸棒杆菌(野生型)培养在含候 选化合物的培养基中，所述培养基优选分别是BHI和BHIS培养基或其相应固体培养基。
11.用于筛选靶向结核杆菌的药物的组合的产品，其包括谷氨酸棒杆菌(野生型)和候 选化合物。
12.权利要求11的产品，其用于筛选靶向结核杆菌细胞壁核心合成与组装的药物。
13.权利要求11的产品，其还包括渗透压维持剂，例如山梨醇。
14.权利要求11的产品，其还包括阳性对照化合物，如乙胺丁醇。
15.权利要求11的产品，其还包括培养基，所述培养基优选是BHI和BHIS培养基或其 相应固体培养基。
16.谷氨酸棒杆菌(野生型)用于筛选靶向结核杆菌的药物的用途。
17.权利要求16的用途，其用于筛选靶向结核杆菌细胞壁核心合成与组装的药物。
全文摘要
本发明涉及一种筛选靶向结核杆菌的药物的方法，更具体而言涉及一种筛选靶向结核杆菌细胞壁的药物的方法。本发明采用谷氨酸棒杆菌为检定菌，以BHI和BHIS培养基为筛选介质，建立靶向结核杆菌细胞壁核心的合成与组装的筛选模型，从微生物代谢产物及其他来源的样品中筛选作用于结核杆菌细胞壁核心的合成与组装过程中不同酶系、不同靶点的新型抗结核药物和先导化合物。通过本发明的筛选模型可以筛选到靶向结核杆菌细胞壁核心的合成与装配全过程的抗结核药物，该模型是一个细胞水平的高通量筛选模型。
文档编号C12R1/32GK101906461SQ20091014352
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月3日 优先权日2009年6月3日
发明者关艳, 熊小椒, 肖春玲, 郝雪秦, 高鹏 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所