专利名称：均相荧光探针pcr结核杆菌检测方法
技术领域：
本发明涉及一种PCR结核杆菌的检测方法。
聚合酶链式反应(PCR)是80年代后期发展起来的一种体外扩增DNA片段的技术，可以在数小时内获得数百万个特异DNA序列拷贝。从理论上讲，PCR结合电泳检测的灵敏度可达1个结核菌，但是临床标本中存在对扩增反应有抑制作用的因素，使PCR检测的灵敏度降低，另外由于PCR反应的高灵敏性，扩增产物的污染又容易产生假阳性，假阳性和假阴性造成PCR检测的灵敏度和特异性与理论上的差距较大。
本发明的目的是采用核酸扩增反应结合探针杂交技术改善PCR检测的灵敏度和特异性。
本发明根据结核杆菌(TB)基因序列，设计合成引物，用聚合酶链式反应(PCR)对TB特异性片段进行扩增，使用分子信标探针与扩增产物杂交，作为结果测定的方法，通过荧光计直接测量反应管的荧光强度，检测标本是否存在结核杆菌。分子信标探针是一种基于荧光能量转移现象设计的发夹型寡核苷酸探针，空间结构上呈茎环结构，环序列是与靶核酸互补的探针，茎序列由与靶序列无关的互补序列构成，茎的一端连上荧光分子，另一端连上淬灭分子，无靶序列时，分子信标的空间结构不变，荧光分子与淬灭分子非常接近，此时荧光被淬灭；有靶序列时，分子信标的环序列可与靶序列特异性结合，茎环结构打开，荧光分子与淬灭分子分开，此时荧光分子就可发出荧光，发出的荧光通过荧光测定仪就可检测到。其主要过程如下根据PCR反应原理，选择合适的Taq酶，dNTP等原材料，合成特异性引物，另外，加入分子信标探针，配制成PCR反应体系。并且用样品提取液(三蒸水配制，内含2％TritonX-100、1％NP-40和0．04M辛酸钠)进行临床样品提取，然后，进行PCR扩增，反应完成后通过测量反应液荧光强度的改变判断样品的阴阳性。
TB探针在两引物扩增片段内设计与靶序列互补的寡核苷酸探针，5’端用EAM修饰，3’端用氨基修饰。EAM-5′-GCG AGG AAC GGC TGA TGA CCA AAC TCT CGC-3′DABCYL(划线部分为发夹柄部，未划线部分为与靶序列特异性互补序列)其空间结构如下 本发明利用分子信标探针，PCR扩增完成后在袖珍荧光仪上直接读数，判定阴阳性。分子信标两端分别标有荧光剂和淬灭剂，产生荧光能量传递，根据Forster理论，荧光能量转移效率与荧光物质-淬灭剂之间距离的6次方成反比，分子信标在发夹状态由于荧光剂与淬灭剂极端靠近，荧光的传递效率几乎是100％，因而荧光几乎完全被淬灭。而当展开时由于荧光剂与淬灭剂的距离增加很大，荧光剂的荧光几乎100％恢复。所以本试剂的信号／背景比非常高，故灵敏度很高。另外分子信标与靶序列的结合需首先消耗能量展开发夹柄，若发夹环与靶序列不能完全匹配即使一个碱基的差异，结合后释放的能量也不抵展开发夹柄消耗的能量，从而使杂交过程最终无法完成。发夹柄能垒的设置使“分子信标”的杂交特异性明显提高。加上与袖珍荧光仪操作简单，适合于临床检验使用。
本发明实施例如下将本发明配制如下试剂盒其原料选用如下TB引物参考以TB插入序列IS986设计合成引物，该引物具群特异性，由上海生工生物工程公司合成。INS-15‘-CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC-3’INS-25‘-GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA-3’TB探针在两引物扩增片段内设计与靶序列互补的寡核苷酸探针，5’端用FAM修饰，3’端用氨基修饰，由上海生工生物工程公司合成。
FAM-5′-GCG AGG AAC GGC TGA TGA CCA AAC TCT CGC-3′-NH2Taq酶上海Promega公司，浓度5U／μl，附Taq贮存缓冲液(50％甘油，20mM Tris-HCl(pH8．0)，100mM KCl，0．1mM EDTA，1mM DTT，
0．5％Tween-20，0．5％N P-40)。dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)购自Pharmacia公司，浓度100mM。
样品来源阳性样品上海生物制品所生产的卡介苗及阳性临床标本，购自生物制品鉴定所结核菌液。阴性样品收集健康人痰液等。
PCR薄壁反应管购自美国PE公司，规格0．5ml。化学试剂DABCYL-SE美国Molecular Probes。
荧光素标准液美国Bio-Rad，1mM DMSO溶液。
NP-40美国AMRESCO。
TritonX-100美国AMRESCO。
Tris美国AMRESCO。
石蜡油Sigma。
辛酸钠Sigma。
其它化学试剂均为国产分析纯。
制造程序TB分子信标探针的标记和纯化根据生产厂家提供的合成量，配置100μM探针的NaHCO3-Na2CO3溶液(0．1M，pH9．0)50μl，向其中缓慢加入10μl 200mg／ml DABCYL-SE的N，N-二甲基甲酰氨溶液，搅拌反应过夜。离心去除沉淀，溶液过G-25柱(0．1M醋酸三乙氨，pH6．5预平衡)除去游离染料。上C-18反相柱(Waters)中压色谱(Bio-Rad)纯化，线性洗脱，20％-70％溶液B(0．1M醋酸三乙氨CH3CN=25∶75(V／V)，pH6．5)；溶液A0．1M醋酸三乙氨，pH6．5；流速1ml／min；时间20min。用260nm波长检测，收集主峰。最后用Nanosep 3K(Gelman)超滤浓缩，溶于100μl缓冲液中(10mM Tris-HCl pH8．3，1．5mMMgCl2)，以紫外分光光度计定量。调浓度为100μM，-20℃贮存。
PCR反应混合液配制10×PCR缓冲液配制100mM Tris-HCl(pH8．3)500mM KCl20mM MgCl21％ TritonX-100用三蒸水配制，高压灭菌，密封，-20℃贮存。
TB引物的溶解及测定根据生产厂家提供的合成OD值，用三蒸水溶解，用紫外分光光度计检测引物含量，调引物浓度为100μM。
PCR反应混合液10×PCR缓冲液用无菌三蒸水8倍稀释，内含TB两引物各0．5μM，探针0．25μM，dNTP 250μM。
PCR反应混合液分装无菌分装于0．5ml离心管，每支0．45ml。
含酶反应管配制Taq酶配制用Taq酶贮存缓冲液稀释Taq酶成1U／μl。
分装于0．5ml PCR薄壁管内，每管1．2μl，加50μl石腊油。
样品提取液配制三蒸水配制，内含2％TritonX-100、1％NP-40和0．04M辛酸钠。
分装高压灭菌后分装至1．5ml离心管内，每管体积1．2ml。
阴阳性对照阴性对照配制健康人痰液经胰酶消化后，1∶20稀释于0．9％生理盐水。
阳性对照配制阴性对照稀释生检所提供结核菌，含量103个菌／ml。
分装无菌分装于0．5ml离心管，每支0．5ml。
调零管和校正管；调零管分装Taq酶储存缓冲液(不含Taq酶)分装于0．5ml PCR薄壁管内，每管1．2μl，加50μl石腊油。
校正管分装含30nM的标准荧光素溶液分装于0．5ml PCR薄壁管内，每管50μl。
检测步骤(一)痰液样本处理1自痰液中加入2倍体积的4％NaOH，反复振摇，置室温20分钟，使之充分液化。
2取0．5ml液化痰液加至0．5ml离心管内，于高速台式离心机1．4万转／分离心10分钟，弃上清液。
3加灭菌蒸馏水0．5ml于沉淀中，振荡混匀，1．4万转／分离心10分钟，弃上清液。
4重复步骤(3)。
5加样品提取液50μl于沉淀中，振荡混匀后，置100℃水浴中15分钟，取出后，样品管1．5万转／分离心5分钟，上清液即可作为反应模板。
6阳性对照和阴性对照不需用NaOH液化，直接1．4万转／分离心10分钟，弃上清液。进行第5步即可。
(二)PCR扩增反应取出含酶反应管加入20μl反应混合液，再加4μl已处理的样品上清(调零管中直接加入20μl反应混合液和4μl样品提取液)，混匀(注意不可剧烈振动，避免产生过多泡沫)后，1万转／分离心20秒，即可按以下程序上PCR扩增仪进行循环。 (三)结果判断1．仪器校准先将调零管放入TD-360型荧光仪中进行调零，再将校正管放入荧光仪，校正读数为1000。
2．样品测定将从PCR扩增仪中取出的反应管逐一放入荧光仪中读数。
3．结果判断样品荧光强度／阴性对照荧光强度≥2．0为阳性样品荧光强度／阴性对照荧光强度＜2．0为阴性(注阴性对照荧光强度＜50时，按50计)本发明利用分子信标探针，PCR扩增完成后在袖珍荧光仪上直接读数，判定阴阳性。不仅消除了扩增产物的污染，简化了操作，更由于独特的分子信标探针的存在，保证了测定的特异性和灵敏度，并且有可能发展为定量测定。加上与袖珍荧光仪操作简单，适合于临床检验使用。
权利要求
1．一种均相荧光探针PCR结核杆菌检测方法，其特征采用PCR方法扩增结核杆菌(TB)基因序列，利用分子信标与扩增产物杂交，并且测量反应液的荧光强度，进行结果测定。
2．根据权利要求1的均相荧光探针PCR结核杆菌检测方法，其特征在于选择TB引物为结核杆菌插入序列IS986的一对引物ISN-15’-CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC-3’INS-25’-GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA-3’。
3．根据权利要求1的均相荧光探针PCR结核杆菌检测方法，其特征在于其TB探针在两引物扩增片段内设计与靶序列互补的寡核苷酸探针，5’端用FAM修饰，3’端用氨基修饰，并标记DABCYL其序列为FAM-5，-GCG AGG AAC GGC TGA TGA CCA AAC TCT CGC-3’DABCYL。
4．根据权利要求1的均相荧光探针PCR结核杆菌检测方法，其特征在于均相荧光探针PCR结核杆菌检测试剂盒包括含酶反应管；反应混合液；阳性对照；阴性对照；样品提取液；调零管；校正管；使用说明书。
5．根据权利要求1的均相荧光探针PCR结核杆菌检测方法，其特征在于均相荧光探针PCR结核杆菌检测试剂盒反应混合液为10×PCR缓冲液(100mMTris-HCl pH8．3；500mM KCl；20mM MgCl2；1％TritonX-100)用无菌三蒸水8倍稀释，内含TB两引物各0．5μM，探针0．25μM，dNTP 250μM。
6．根据权利要求1的均相荧光探针PCR结核杆菌检测方法，其特征在于均相荧光探针PCR结核杆菌检测试剂盒含酶反应管为用Taq酶贮存缓冲液稀释Taq酶成1U／μl。分装于0．5ml PCR薄壁管内，每管1．2μl，加50μl石腊油。
7．根据权利要求1的均相荧光探针PCR结核杆菌检测方法，其特征在于均相荧光探针PCR结核杆菌检测试剂盒调零管为Taq酶储存缓冲液(不含Taq酶)分装于0．5ml PCR薄壁管内，每管1．2μl，加50μl石腊油。
8．根据权利要求1的均相荧光探针PCR结核杆菌检测方法，其特征在于样品提取液为三蒸水配制，内含2％TritonX-100，1％NP-40和0．04M辛酸钠。
9．根据权利要求1的均相荧光探针PCR结核杆菌检测方法，其特征在于分子信标的制备过程如下取100mM探针的NaHCO3-Na2CO3溶液50μL，向其中缓慢加入10uL200mg／ml DABCYL-SE的N，N-二甲基甲酰氨溶液，搅拌反应过液。离心去除沉淀，溶液过G-25柱(0．1M醋酸三乙氨，pH6．5预平衡)除去游离染料。上C-18反相柱(Waters)中压色谱(Bio-Rad)纯化，线性洗脱，20-70％溶液B(0．1M醋酸三乙氨CH3CN=25∶75(V／V)，pH6．5)。溶液A0．1M醋酸三乙氨，pH6．5流速1mL／min时间20min。用260nm波长检测，收集主峰，最后用Nanosep3K(Gelman)超滤浓缩。
全文摘要
本发明根据结核杆菌(TB)基因序列,采用TB染色体插入序列IS986设计合成引物,用聚合酶链式反应(PCR)对TB特异性片段进行扩增,使用分子信标探针与扩增产物杂交,作为结果测定的方法,通过荧光计直接测量反应管的荧光强度,检测标本是否存在结核杆菌。
文档编号G01N33/50GK1281901SQ9911233
公开日2001年1月31日 申请日期1999年7月22日 优先权日1999年7月22日
发明者李庆阁, 梁基选, 栾国彦 申请人:厦门泰伦生物工程有限公司