专利名称：：前极核性白内障致病基因及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种人体变异的基因，具体地说是一种前极核性白内障致病基因CRYAA。本发明还涉及这种变异基因在检测疾病中的应用。
背景技术：
：先天性白内障(congenitalcataract,CC)是一种常见的眼部异常，可导致明显的牙见力障碍或者儿童盲，约占世界儿童盲的1/10。先天性白内障可以孤立发生，可以合并其它眼部发育异常，或者是遗传性多系统综合症的一部分。大约1/3-1/4的先天性白内障是遗传性的，常染色体显性、常染色体隐性和X-连锁三种遗传方式都有报道。遗传性先天性白内障大多是常染色体显性，几乎完全外显但是表现度各不相同。尽管先天性白内障是世界儿童盲的主要原因，其遗传基础和发病机制尚不十分清楚。对先天性白内障致病基因的定位与克隆是了解其发病的分子机制的重要步骤。近年来，随着分子生物学技术和生物信息学的迅猛发展，越来越多的先天性白内障致病基因被定位和克隆。迄今为止，对常染色体显性遗传先天性白内障，已明确定位的位点有30余个，已找到的致病基因有20余个。先天性白内障的致病基因目前可以分成5类(1)晶体蛋白基因，包括CRYAA,CRYAB,CRYBB1,CRYBB2,CRYBB3,CRYBA1/A3,CRYBA4,CRYGC,CRYGD,和CRYGS。(2)膜蛋白基因，包括MIP,LIM2.(3)缝隙连接蛋白基因，包括GJA8,GJA3。(4)细胞骨架蛋白基因，包括BFSP1,BFSP2。(5)发育调节因子基因，包括PITX3,MAF,HSF4,FOXE3,EYA1,CHX10和PAX6等。中国专利申请200710144506.X^Hf了CRYGC基因变异与先天性核性白内障的关系，CRYGC基因第3外显子第470碱基一个G->A的点突变，导致编码第157位色氨酸的密码子变成了终止密码子(W157X)。并确定该点突变是先天性核性白内障的致病基因突变。由于先天性白内障的临床症状及实验室检测指征具有许多类型，而且研究显示，不同的临床类型分别与不同的基因突变相关。即使是同一基因，点突变的位点不同，由此导致先天性白内障的症状就有可能不同。因此有必要对白内障的各种临床类型，尤其是还没有发现相关的分子遗传学基础的临床类型进行研究，以确定其精确的变异基因名称和位点，并根据该变异建立起方便、快速和准确的检测方法，用于先天性白内障的诊断。
发明内容本发明的目的在于提供前极核性白内障的致病基因，定位出该疾病的基因突变位点，并利用该基因突变，提供检测人体中是否存在该基因突变的方法。本发明针对一个前极核性白内障家系，用基因扫描与连锁分析的方法对致病基因进行染色体定位和候选基因突变检测。在排除了大部分先天性白内障相关染色体区域后，将致病基因初步定位于第21号染色体。经过精确定位，将致病基因定位于染色体21q22.11-q22.3。通过对此定位区域内先天性白内障的候选基因CRYAA基因双向测序发现一个新的点突变。通过对家系正常成员和100名正常对照GJA3基因测序未发现此突变，排除了单个核普酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)的可能性。从而确定CRYAA基因突变是前极核性白内障的致病基因突变。由此，本发明提供了一种如SEQIDNO:l所示的变异的人类CRYAA基因，其特征在于，所述CRYAA基因第3外显子第347位碱基的G突变为A。正常的人类CRYAA基因如SEQIDNO:2所示。本发明还提供了一种含有上述述基因的点突变的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸含有从点突变向两侧或一侧延伸至少50个以上至1000个碱基之间长度的核香酸。本发明进一步提供了所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸含有从点突变向两侧或一侧延伸至少300-600个个石威基之间长度的核苷酸。本发明还提供了一种检测来源于人体的生物样本中是否存所述基因的点突变的方法，其包括步骤(1)从所述样本中提取和纯化基因材料；(2)对所述基因材料进行聚合酶链扩增反应，获取产物；(3)对所述产物进行核苦酸序列测定，以确定所述生物样本中是否含有CRYAA基因的点突变。优选地，所述生物样本为体液，所述体液包括但不限于血液、血清、羊水、淋巴液等。优选地所述体液为血液。优选地，在所述聚合酶链扩增反应使用的引物对为SEQIDNO:6和7;本领域技术人员还可以根据聚合酶链扩增反应的要求，设计更多种的引物，以扩增出包含本发明所述变异位点的核苷酸序列。本领域技术人员以该核苷酸为基因探针，根据基因杂交的原理，可以检测生物样本中是否存在与该探针序列互补的核苷酸序列。因此使用这种方法也可以检测出样本中是否存在着本发明的基因突变位点。的方法，其包括步骤(1)从所述样本中提取和纯化基因材料；(2)使步骤(1)获得的基因材料与权利要求1-3任一项所述的核苷酸进行接触。(3)观察经过步骤(2),所述基因材料与所述核苷酸是否存在基于序列特异性的杂交结合。优选地，所述生物样本为血液。根据本发明提供的CRYAA^因序列变异的位点，应用本发明提供的检测来源于人体的生物样本中是否存所述基因的点突变的方法，对一个前极核性白内障家系正常汉族个体进行了检测。结果显示家系所有白内障患者都具有相同的点突变，而家系内其余正常个体和100名正常对照都没有此突变。证明本发明提供的方法能够精确地诊断先天性前极核性白内障，并能与其他先天性白内障相区别。图1为突变序列SEQIDNO:l与正常序列SEQIDNO:2在突变位点的对比示意图。具体实施例方式以下结合实施例对本发明进行更为详细的描述，但是以下描述仅用于对本发明进行解释性说明，并不对本发明的保护范围进行任何的限制，本发明的保护范围仅以权利要求书限定的范围为准。实施例l:CRYAA基因变异的定位(一)基因组DNA的提取使用QIAGEN7〉司QIAampDNABloodMiniKit试剂盒抽提血液样品基因组DNA。(二)基因扫描分初步扫描和精细扫描两步进行。首先对已报道的候选区域进行初步扫描，之后在阳性区域内进行精细扫描。1、孩i卫星坤示"i己#刀步43#苗用遗4专才示"i己净勿来自Linkagemappingsetversion2.5(美国AppliedBiosystems公司)；精细扫描用荧光标记物选自Marshfield网站，序列及相关信息来自NCBI网站，由美国Invitrogen公司合成，5'端FAM荧光标记。2、多重PCR扩增5pLPCR反应体系包含模板DNAlpL,10xPCRbuffer0.5pL，dNTP0.8nL,Mg2+0.3)iL,引物(正反向lOpmol/pL)0.05jiL,HotStarTaqDNA聚合酶0.06pL，余下体积由灭菌双蒸水补足。PCR反应条件采用"Touchdown"方式预变性94。C变性30sec,复性温度从64。C开始，每进行一个热循环复性温度降低0.5。C一直降至57°C,热循环中复性的时间为lmin,延伸为恒定72。C下1.5min,这个过程一共14个热循环。经过这个条件后，反应进入第二轮，即恒定扩增期。将复性温度设定为56°C,其它条件不变，进行30个热循环。3、基因分型PCR产物lpl与MegaBACE1000TMET400-RSize(与去离子水以27:100稀释)6^1混合，95。C变性5min，立即冰浴。在MegaBACE1000DNA分析仪(英国AmershamPharmaciaBiotech公司)上电泳lh,经软件扫描并收集图像信息，并由GeneticProfiler2.1软件分析，获得基因分型数据。4、连锁分析对基因分型结果进行人工校对后，采用Linkagev5.1软件包中的Mlink连锁分析软件进行两点间连锁分析。分别在重组率(0)为O.OO,0.10,0.20,0.30,0.40和0.50时计算对数优势计分(logoddsscore,LOD)值。结果判断标准LOD值>l为提示连锁，>2为支持连锁，〉3为肯定连锁，<-2为否定连锁。(三)一青细定位在得到的阳性区域附近选择了更为精细的微卫星标记。遗传标记选择来自于marshfield和ncbi网站。每对引物合成时在其中一条的5'端用FAM(蓝色)荧光染料标记，PCR条件、标记的基因分型与连锁分析的方法均同上。(四)单体型分析利用Cyrillic软件产生一个家系图谱，图谱中可以显示每个成员的多个遗传标记的分型信息。对这些信息根据上下代遗传关系进行手动调节即可排列出每个个体的单体型。根据单体型在患者个体中共享的情况，可以发现交换的发生进而可得到最终由所有患者共享的一段最小的区域。这段所有患者共享的一段最小的区域即是该家系致病基因在染色体上的定位区域。通过上述步骤将CRYAA基因定位于位于21号染色体21q22.11-q22.3。基因的染色体定位技术在分子遗传学领域对于本领域技术人员而言是已知的技术，本发明是利用这些已知的技术去发现可能给人类带来疾病的变异基因。实施例2:变异基因的测序(1)使用QIAGEN公司QIAampDNABloodMiniKit试剂盒抽提血液样品基因组DNA;(2)对样本DNA目标片段进行PCR体外扩增，目的是扩增出CRYAA的三个外显子(其中第个外显子的核苷酸序列如SEQINNO:2所示)，共用了3对引物扩增3个外显子(表1)，PCR反应体系如表2所示，PCR反应程序如表3所示。表1前极核性白内障家系CRYAA基因外显子1-3测序引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>PCR反应在9700PCR仪上进行。表3:PCR反应程序<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>PCR产物电泳检测PCR反应结束后，取2pl反应产物加入2ja1的2xLoadingBuffer,4000rpm离心30秒，上样在1.5%的琼脂糖凝胶中，100V电压下电泳15min,凝胶摄像仪拍摄检测；(3)对PCR产物进行纯化采用SAP(北极奸碱性磷酸酶)降解残余dNTP,Exo(核酸外切酶)降解残余引物，将SAP和Exo两种酶和lOx緩冲液预先混合后保存，每微升混合液中含SAP和EXO各0.5单位，对于每个纯化反应，取PCR产物1.5-2nl加入SAP酶1.5nl,反应程序为SAP/Exo在37。C处理PCR产物40分钟，接着85。C持续20分钟灭活SAP/Exo酶，然后4。C保温；(4)对PCR产物进行测序测序反应体系为5|il，包含纯化后的PCR产物，测序引物3.2pmol以及BDT(BigDyeTerminator3.1,AppliedBiosystems)。0.5(li1,剩下体积用ddH20补齐，测序反应程序如表4所示表4测序反应程序<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>测序反应结束后，需要对测序产物再次纯化(测序后纯化)，以除去测序反应带来的小分子物质，避免其对测序的干扰。纯化步骤如下1)测序反应的96孔板中每孔加25pl醋酸钠一乙醇溶液(3M醋酸钠+100%乙醇，体积比为l:25);4。C,4000rpm离心45分钟；倒置，600rpm离心l分钟甩干。2)再加入50nl70%乙醇溶液；4°C,4000rpm离心IO分钟；倒置600rpm离心l分钟甩干；重复一次。3)室温静置约半小时让其自然干燥。在测序以前先要使DNA样品变性。变性的方法是在纯化后的样品中加入10nlHiDi(去离子曱酰胺)，在PCR仪上95。C保持5分钟使之完全变性。变性后即刻放入冰中至少2分钟防止其复性。接着上样至ABIPRISM3100测序仪/分型仪(AppliedBiosystems)进行测序。(5)测序结果分析应用SEQUENCEANALYSIS软件对测序结果进行分析。应用NCBI数据库的BLAST程序(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast7bl2seq/wblast2.cgi)，将发现的突变序列与基因组序列进行比较，对测序结果进行比对分析。排除SNP的可能性后，对家系所有成员和IOO名正常对照进行测序，判断突变是否与家系共分离。通过表1所示的3对引物进行PCR扩增，经对产物的测序分析显示，本发明所述的第3外显子产生G->A点突变的第347石威基位于第3对引物(即SEQIDNO:8和9所示)的扩增范围内，因此，该对引物可用于对先天性前极核性白内障致病基因CRYAA的基因突变的才企测。实施例3:对一个先天性前极核性白内障家系进行CRYAA基因变异的检测为了验证本发明的效果，我们收集到黑龙江省的一个先天性前极核性白内障家系。家系成员经调查走访或做全身检查以排除其它眼部疾病和系统异常。对家系成员进行了详细的眼科检查，包括视力、裂隙灯显微镜、散瞳后的眼底检查。所有患者经眼科裂隙灯检查以确认白内障类型，裂隙灯显微镜拍照，记录患者的白内障表型。所有参加调查和被采集血样的家系成员都了解本研究的目的意义并签署了知情同意书。该家系共4代，57个家系成员，其中男30人，女27人，患者12人，正常45人。抽取志愿者外周静脉血5m1,用EDTA作抗凝处理后，-2(TC水箱保存。另外采集正常汉族个体IOO人，采集外周静脉血5ml，EDTA抗凝，-20"冰箱保存.作为对照组。100名正常对照的测序结果与家系正常人的测序结果完全一致。双向测序结果表明先天性前极核性白内障家系的CRYAA基因第3外显子第347碱基，有一个G》A的点突变(如SEQIDNO:l所示，SEQIDNO:2为未发生变异的正常序列，见图l矩形方框所示)，导致多肽编码序列的第116位精氨酸密码CGC》变为组氨酸密码CAC(见图1两条虚线所示)，即R》H,或者Arg->His(如SEQIDNO:3所示)。家系所有白内障患者都具有相同的点突变，而家系内其余正常个体和100名正常对照都没有此突变。从而排除了它是罕见的SNP的可能性。确定CRYAA基因突变是该家系的致病基因突变。序列表<110>哈尔滨医科大学〈120〉前极核性白内障致病基因及其检测方法<130>KLPI090071<160>9<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉522<212>DNA<213〉Homosapiens<400>1atggacgtgaccatccagcacccctggttcaagcgcaccctggggcccttctaccccagc60cggctgUcgaccagtttttCggCgElgggCctttttgagtatgacctgctgcccttcctg120tcgtccaccatcagcccctactaccgccagtccctcttccgcaccgtgctggactccggc180atctctgaggttcgatccgaccgggac卿ttcgtcatcttcctcgatgtg幼gcaicttc240tccccggaggacctcaccgtg卿gtgcaggacgactttgtggagatccacggaaagcac300aacgagcgccaggacgaccacggctacatttcccgtgagttccaccaccgctaccgcctg360ccgtccaacgtggaccagtcggccctctcttgctccctgtctgccgatggcatgctgacc420ttctgtggccccaagatccagactggcctggatgccacccacgccgagcgagccatcccc480gtgtcgcgggaggag鄉cccacctcggctccctcgtcct522<210〉2〈211〉522<212>腿<213>Homosapiens<400>2atggacgtgaccatccagcacccctggttcaagcgcaccctggggcccttctaccccagc60cggctgttcgaccagtttttcggcgagggcctttttgagtatgacctgctgcccttcctg120tcgtccaccatcagcccctactaccgccagtccctcttxcgcaccgtgctggactccggc180atctctgaggttcgatccgaccgggacaagttcgtcatcttcctcgatgtgaagcacttc240tccccggaggacctcaccgtgaaggtgcaggacgactttgtggagatccacgga犯gcac300aacgagcgccaggacgaccacggctacatttcccgtgagttccaccgccgctaccgcctg360ccgtccaacgtggaccagtcggccctctcttgctccctgtctgccgatggcatgctgacc420ttctgtggccccaagatccagactggcctggatgccacccacgccgagcgagccatcccc480gtgtcgcgggagg卿agcccacctcggctccctcgtcct肌522<210〉3<211>160<212〉PRT<213〉Homosapiens<400〉3MetAspValThrlieGinHisProTrpPheLys1510ArgThrLeuGlyPro15PheTyrProSerArgLeuPheAspGinPhePhe2025GlyGluGlyLeuPhe30<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula><400>7gtccctctcccagggttg18<210〉8<211〉18<212〉腿<213>人工序列<220><223>引物"00>8cccccttctgcagtcagt18<2L0〉9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400>9gggaagcaaaggaagacaga20权利要求1.一种如SEQIDNO1所示的变异的人类CRYAA基因，其特征在于，所述CRYAA基因第3外显子第347位的碱基G突变为A。2.—种含有权利要求1所述基因的点突变的核苦酸，其特征在于，所述核普酸含有从点突变向两侧或一侧延伸至少50个以上至1000个碱基之间长度的核苷酸。3.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸含有从点突变向两侧或一侧延伸至少300-600个个》威基之间长度的核苷酸。4.一种检测来源于人体的生物样本中是否存在权利要求1所述基因的点突变的方法，其包括步骤(1)从所述样本中提取和纯化基因材料；(2)对所述基因材料进行聚合酶链扩增反应，获取产物；(3)对所述产物进行核普酸序列测定，以确定所述生物样本中是否含有权利要求1所述基因的点突变。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物样本为体液。6..才艮据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述体液为血液。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述聚合酶链扩增反应使用的引物对为SEQIDNO:8和9;8.根据权利要求1-3任一项所述的核苷酸在在制备先天性白内障疾病基因诊断芯片中的应用。9.一种检测来源于人体的生物样本中是否存在权利要求1所述基因的点突变的方法，其包括步骤(1)从所述样本中提取和纯化基因材料；(2)使步骤(1)获得的基因材料与权利要求1-3任一项所述的核苷酸进行接触。(3)观察经过步骤(2),所述基因材料与所述核苷酸是否存在基于序列特异性的杂交结合。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述生物样本为血液。全文摘要本发明涉及一种前极核性白内障致病基因CRYAA，在前极核性白内障病人的CRYAA基因第3外显子第347碱基G-＞A的点突变。本发明还涉及这种变异基因在检测疾病中的应用。本发明提供的方法能够精确地诊断前极核性白内障，并能与其他先天性白内障相区别。文档编号C12Q1/68GK101525619SQ20091013157公开日2009年9月9日申请日期2009年4月7日优先权日2009年4月7日发明者平刘,璐张申请人:哈尔滨医科大学