专利名称：一种检测人结核杆菌相关易感基因cish +1320位点的单核苷酸多态性的方法
技术领域：
本发明属于医学分子生物学领域，涉及一种检测人结核杆菌相关易感基因CISH+1320位点的单核苷酸多态性的方法。
背景技术：
随着人类基因组测序计划的完成，人类已进入后基因组时代。该时代的研究重点是个体间的遗传差异。这种差异最常见的是单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism, SNP)，即在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，它具有密度高、遗传稳定、易于自动化分析等特点，被认为是继限制性片段长度多态性、微卫星多态性之后的第三代遗传标记，可用于基因定位、多态性分析等方面，是研究疾病易感性、 疾病诊断、药物筛选等的常用指标。单碱基延伸法(single base primer extension)又称微测序法、模板介导染料终止剂掺人分析或单核苷酸多态性鉴定技术(single-nucleotidepolymorphism-identification technology, SNP-IT),是在双脱氧测序法的基础上发展出来的单核苷酸多态性检测方法。其原理是首先设计I对PCR引物，从基因组DNA中扩增出含有目的单核苷酸多态性位点的片段，再设计I条与待测单核苷酸多态性位点上游序列互补的延伸引物，该引物的3’端最后一个碱基与单核苷酸多态性位点上游相邻的I个碱基互补，将延伸引物与PCR产物混合，掺入标记不同荧光染料的ddNTPs进行延伸反应，由于ddNTP的特性，当延伸I个碱基，即加入的ddNTP与单核普酸多态性位点碱基互补时，反应即终止，通过检测延伸碱基所发出的荧光类型来判断单核苷酸多态性位点的碱基类型。CISH 基因编码 Cytokine-inducible SH2_containing protein,可调节白细胞介素-2 (IL-2)的信号传导途径，其特定的基因型与细菌、病毒、结核杆菌和疟疾的易感性相关。Khor CC等人通过病例对照研究，分析二十余种免疫相关基因单核苷酸多态性与细菌、结核和疟疾感染的相关性。研究发现，CISH-639、-292、-163、+1320和+3415位点的单核苷酸多态性与细菌、结核杆菌和疟疾的易感性相关，其中，CISH+1320位点多态性与结核杆菌易感性的相关性最强。(Khor CC, et al. CISH and susceptibility toinfectiousdiseases. N Engl J Med. 2010;362(22):2092 - 2101.)
发明内容
本发明的目的是建立并优化了 PCR-荧光标记单碱基-毛细管电泳分离检测技术检测人CISH+1320位点基因型的方法。本发明所述方法包括以下步骤I、CISH+1320位点扩增引物及延伸引物设计与合成从NCBI Gene bank上下载人CISH基因核酸序列(登录号NC_000003)，保存成fasta格式。米用 Primer3(http://frodo. wi. mit. edu/)设计引物(见表 I),BLASTChttp://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)验证所设计引物的特异性。设计好的引物委托上海invitrogen合成，采用HPLC纯化。2、基因组DNA样品制备采集受试者静脉血2mL，入乙二胺四乙酸二钾抗凝管，混匀。采用QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒(货号51104)提取人外周血基因组DNA，按说明书操作，具体步骤如下①I. 5mL EP管中依次加入20yL QIAGEN蛋白酶，200 μ L抗凝全血，200 μ L Bufffer AL，室温下涡旋混匀15秒；②56°C孵育lOmin，瞬时离心；③加入200 μ L无水乙醇，室温下涡旋混匀15秒，瞬时离心；④将裂解产物转移至提取柱上，6000g离心I分钟，弃滤过液；⑤加入500 μ LBuffer Affl,6000g离心I分钟，弃滤过液;⑥加入500 μ LBuffer AW2，20000g离心3分钟，弃滤过液;⑦换收集管，加入100 μ LBuffer AE，6000g离心I分钟洗脱，将DNA溶液置超低温冰箱保存。3、PCR扩增目的片段按下列反应体系配置PCR反应液,加入O. 2mL PCR管中。
权利要求
1.一种检测人结核杆菌相关易感基因CISH+1320位点的单核苷酸多态性的方法，其特征方法在于检测方法包括如下步骤 (1)设计CISH单核苷酸多态性位点的扩增引物及延伸引物； (2)制备人全血基因组DNA样本； (3)PCR扩增靶片段； (4)PCR扩增产物纯化； (5)单碱基延伸反应制备CISH1320+位点多态性的样本； (6)采用毛细管电泳检测样本单核苷酸多态性位点； (7)采用Fragment程序分析，根据片段分析结果中单碱基延伸所产生的峰来判读相应的碱基，确定CISH+1320位点的单核苷酸多态性。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于可进一步采用测序方法，验证PCR-单碱基延伸检测方法的准确性。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于设计的单核苷酸多态性位点扩增引物的上游引物序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 2所示；延伸引物序列如SEQID NO. 3 所示。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在步骤(3)中的PCR反应体系。
dd H2O27pL IOx PCR缓冲液(不包含Mg2+)5 μ MgCl2 (25mM)3 pL dNTP2 ‘liL 上游引物(ΙΟμΜ)I μ , 下游引物(ΙΟμΜ)IpL。 rTaq 酶I IiL 基因组DNA10 μL 总体积-----------------------------------------------50 μ
5.根据权利要求I或4所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的PCR循环条件为94-98°C变性30秒，56-68°C退火60秒，72°C延伸30-180秒，共30-40个循环；最佳循环反应条件为94°C 30秒，64°C 30秒，72°C 30秒，共35个循环。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于根据BeckmanCEQ8000遗传分析仪分析软件(9. O版本)中的片段分析(Fragments)程序的软件判断结果,评价人CISH+1320位点的多态性，或者进一步将该结果和DNA测序的结果进行比较。
全文摘要
本发明属于医学分子生物学领域，公开了一种检测人结核杆菌相关易感基因CISH+1320位点的单核苷酸多态性的方法。该方法应用PCR-荧光标记单碱基-毛细管电泳分离检测技术检测CISH+1320位点多态性，具体方法包括人全血基因组DNA提取、单核苷酸多态性位点扩增引物及延伸引物设计与合成、PCR扩增产物质量验证、单核苷酸多态性位点检测样本的制备及检测、数据分析、与测序结果的对照评价。本发明在保证结果可靠性的基础上，不需要像测序法那样检测较长的无关片段，只需要产生单个碱基的信号，避免了无关片段的复杂结构对检测的干扰，检测周期和成本均显著低于测序法，结果可读性强。
文档编号C12Q1/68GK102912029SQ20121044095
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者俞杨, 王自正, 邬兰, 焦杰, 杜同信, 瞿卫, 谢玉为 申请人:俞杨, 王自正, 邬兰, 焦杰, 杜同信, 瞿卫, 谢玉为