专利名称：一种检测慢性乙肝易感基因的方法及esr1易感基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及慢性乙型肝炎的人群预防中的个体易感性及其遗传学检测方法。具体地，本发明涉及与慢性乙型肝炎患病风险相关的易感基因ESR1的基因型检测方法。本发明进一步涉及上述易感基因基因型的检测试剂盒，以及该试剂盒的应用。另外，本发明还涉及上述检测方法和易感基因在慢性乙型肝炎的预防和控制以及遗传咨询中的应用。
背景技术：
在全球范围内有超过3.5亿的乙型肝炎病毒(HBV)慢性携带者。在我国，HBV感染是最常见的病毒性传染病，其人群感染率为58％，HBV携带者超过一亿，每年乙肝患者花费的医疗费和保健费用高达1000亿人民币。乙肝带来的间接损失预计是直接损失的一倍以上。在中国，可以说乙型肝炎是危害人民健康和造成国民经济损失最严重的传染病。鉴于此，有效预防和治疗该疾病是我国公众健康的一个重要目标。
HBV感染后的临床转归不一，包括自限恢复(即HBV被清除)和转为慢性化状态，后者可进展成无症状携带状态、慢性肝炎、肝纤维化和肝癌。HBV感染后的慢性化已被认为是多因素多基因疾病，是由病毒本身、环境和宿主遗传因素交互作用的结果。HBV本身的基因组变异和多种常规的风险因素(包括年龄、性别和与HCV、HDV和HIV的共感染等)显然是导致持续HBV感染的重要因素。然而，分离分析和双生子研究也强烈支持宿主遗传因素可以在决定HBV感染慢性化的过程中起重要作用。确实，基于冈比亚、欧洲和亚洲人群的遗传关联分析已经认为HBV感染的清除与DRB1*1302等位型有关。除主要组织相容复合物(MHC)基因外，与HBV的持续感染表型相关的基因还有γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNFA)、甘露糖结合凝集素(MBL)和维生素D受体(VDR)等。正如疟疾的易感性所显示的那样，感染性疾病的遗传易感性可决定于多个功能水平，包括细胞因子的产生、抗原提呈和受体的识别等。因此，很有可能尚有许多未鉴定的基因介导HBV感染慢性化的遗传易感性。HBV感染慢性化易感基因的鉴定将有助于此类疾病的风险预测、预防和治疗。
已有研究表明，HBV基因组序列存在糖皮质激素应答元件(GRE)，而雌激素能抑制HBV的复制。已知有两种雌激素受体(ESR)ESR1(estrogen receptor α)和ESR2(estrogen receptorβ)。一项基于日本人群的研究揭示，无症状HBV携带者和慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)胞浆中的ESR1表达水平比健康对照低，导致免疫细胞对雌激素无反应；而INF-α治疗可使PBMC中ESR1水平升高。这些研究结果提示，机体清除HBV功能的缺失很有可能是由于ESRs表达的降低导致机体免疫系统对性激素的无反应性。上述体内外的功能研究结果表明，ESRs表达水平及功能可能在慢性HBV感染的慢性化过程中起重要作用。我们因此假设，ESRs很有可能是HBV感染慢性化的易感基因。ESR1和ESR2基因中的多态性可能影响雌激素的效应，进而导致基因型依赖性的HBV感染慢性化易感性的差异。
有报道指出雌激素发挥作用主要是通过ESR1。本发明的目的是系统筛查ESR1基因的单核苷酸多态性(SNP)，进而在中国人群中检查这些SNP标记和HBV持续感染易感性间的相关性。
发明内容
发明人系统筛查了ESR1基因的SNP，继而考察了ESR1基因的多态性位点T29C与慢性乙肝病毒感染易感性的相关性。通过基于医院的大规模病例对照研究，进行了大量的临床和实验室实验和大样本的统计分析，判明携带ESR1的29T/T等位基因型的个体对慢性乙肝病毒感染有更高的易感性。因此本发明鉴定了慢性乙肝病毒感染的一种新的易感基因和易感基因型。
本发明还提供了一种检测与慢性乙肝病毒感染易感性关联的易感位点T29C的方法，该方法为PCR-RFLP法。
本发明还提供了一种通过检测ESR1基因的T29C位点来判定个体对慢性乙肝病毒感染是否易感的方法。
本发明还提供了用于检测多态性位点T29C的引物对。
本发明进一步提供了一种检测与慢性乙肝病毒感染关联的ESR1基因的T29C位点的试剂盒，以及上述试剂盒在人群中预防与控制慢性乙肝病毒感染的应用。
一、如上所述，本发明提供了一种检测与慢性乙肝病毒感染易感性关联的ESR1基因的T29C位点的方法，该方法为PCR-RFLP法。具体的说，包括了如下步骤1)对ESR1基因T29C位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；2)对PCR产物以限制性内切酶BamH I进行切割，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型，以此判明ESR1基因T29C位点的基因型。
二、另一方面，本发明还提供了与慢性乙肝病毒感染易感性关联的一个易感基因型，即ESR1基因的29T/T基因型为慢性乙肝病毒感染的易感基因型。并提供了一种通过检测ESR1基因T29C位点的基因型来判定人群或个体对慢性乙肝病毒感染易感性的方法。该方法包括1)对ESR1基因T29C位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；2)对PCR产物以限制性内切酶BamH I进行切割，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型，以此判明ESR1基因T29C位点的基因型；3)当某一个体的ESR1基因的T29C位点表现为29T/T基因型时，则表明该个体在HBV感染后转为慢性的可能性更高。
三、检测ESR1基因T29C位点基因型的特异性引物对的序列为正向引物5’-GACCATGACCCTCCACACCAAAGGATC-3’反向引物5’-ACCGTAGACCTGCGCGTTG-3’四、本发明进一步提供了一种检测与慢性乙肝病毒感染关联的ESR1基因的T29C位点的试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有用以检测T29C位点基因型的一种或多种组分。与之同时提供的可以是经政府食品与药品监督管理部门审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售方面的信息。例如，在DNA的PCR扩增方法实施中，直接检测样品的T29C位点的基因型的试剂盒，含有PCR的引物对(5’-GACCATGACCCTCCACACCAAAGGATC-3’和5’-ACCGTAGACCTGCGCGTTG-3’)，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等。本领域技术人员已知，以上的组分仅是示意性的，所述用于PCR反应的DNA聚合酶可以是Taq DNA聚合酶，例如，HotStar Taq酶Klenow片段，Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶等能够用于PCR扩增的酶。但为保证特异性扩增，除了引物和反应条件的优化外，应优选HotStar Taq酶。在PCR产物的RFLP分析中，该试剂盒可含有BamH I内切酶及其缓冲液，显示T29C位点基因型的BamH I酶切图谱等。
使用方法说明如下1)PCR扩增对样品基因组DNA(其具体制备方法参见实施例)，用本发明提供的引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增12.5-μl反应体系为20～100ng基因组DNA，0.2μM引物，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2，1.0unit HotStarTaqTMDNA聚合酶以及1×缓冲液(QIAGEN，Chatsworth，CA)。95℃ 15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94℃30s和72℃50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从65℃开始每个循环降0.5℃，第二阶段扩增的退火温度则固定在61℃，最后的72℃延伸时间为7min。特异性的PCR产物(220bp)以1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
2)RFLP分析对上述经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物，按照如下反应体系和条件进行限制性内切酶的切割消化10μl的反应体系为3μl的PCR产物，4单位的限制性内切酶BamH I，1μl 10×缓冲液和双蒸馏水，37℃恒温过夜。限制性酶切反应终止后，将酶切产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，从而进行基因型判定。基因型区分的依据是220bp的PCR产物以BamH I限制性内切酶消化后，C/C基因型被切割为两条片段，长度分别为197bp和23bp；而基因型T/T则因为没有酶切位点而在消化后只出现220bp一个条带；C/T杂合子经消化后，197bp、23bp和220bp的三个片段均出现。
五、本发明还提供了与慢性乙肝病毒感染易感性关联的ESR1基因T29C位点的检测方法及其在慢性乙肝病毒感染人群预防和控制中的应用。例如，由于本发明证实了ESR1基因T29C位点与慢性乙肝病毒感染易感性存在关联，因此，在慢性乙肝病毒感染人群的预防和控制中，就需要对所咨询的对象进行ESR1基因T29C位点的基因型进行分析，以判断该对象是否携带有慢性乙肝病毒感染易感基因型29T/T。对具有ESR1基因29T/T基因型(表现为对慢性乙肝病毒感染具有更高的易感性)的个体，则可对之进行科学的干预，包括建议接种乙肝疫苗、及早进行治疗性预防等，这样可以针对性地降低这些易感人群的慢性乙肝病毒感染的风险。
图1.限制性内切酶BamH I(购自Promega公司)消化220bp PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道1(自左向右)标准分子量参照物DL2000(购自TaKaRa公司)；泳道4和6C/C基因型酶切鉴定的结果，PCR产物被切割为长度分别为197bp和23bp的两条片段(因为23bp片断过小，电泳图上没有显示)；泳道2和3C/T基因型酶切鉴定的结果，出现长度分别为220bp、197bp和23bp的三条片段(因为23bp片断过小，电泳图上没有显示)；泳道5T/T基因型酶切鉴定的结果，只出现长度为197bp的一个条带。
实施例实施例1该实施例设计并合成了一套引物对，并且在该引物对的基础上，设计了一种检测与慢性乙肝病毒感染易感性关联的ESR1基因T29C位点的方法。
1、基因组DNA的提取采取本领域常规的Miller改良盐析法提取外周血白细胞基因组DNA。
1)取柠檬酸钠或EDTA-Na2抗凝全血5ml(尽量不用肝素抗凝)，置于50ml有盖离心管；2)加入3-5倍体积冷蒸馏水，反复颠倒混匀，冰中放置5分钟，4℃2000rpm离心20分钟；3)缓慢倾倒上清，沉淀加入预冷的0.1％Triton-X100(体积同上)，轻柔混匀沉淀，如上离心，弃上清；4)沉淀加入4ml裂解液(50Mm Tris-Cl-10mM EDTA，pH8.0)，彻底打碎沉淀，然后加入10％SDS至终浓度为0.5％，混匀；5)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度为200μg/ml，混匀，55℃3小时或37℃过夜消化(以过夜消化为佳)；6)加入6M NaCl 1.2ml，剧烈振荡20秒，2，200rpm离心10分钟，将上清转移至另一个有盖离心管；7)加入2倍体积预冷无水乙醇，反复颠倒混匀至出现絮状DNA沉淀，挑出DNA至另一Eppendorf管；8)以75％预冷乙醇洗涤DNA沉淀2次；9)以0.5ml TE(10mM Tris-Cl-EDTA，pH8.0)或蒸馏水溶解DNA沉淀，电泳检测DNA片段大小，或测260/280nm OD比值。
2、PCR扩增用本发明提供的引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增12.5-μl反应体系为20～100ng基因组DNA，0.2μM引物，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2，1.0unit HotStarTaqTMDNA聚合酶以及1×缓冲液(QIAGEN，Chatsworth，CA)。95℃ 15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94℃30s和72℃50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从65℃开始每个循环降0.5℃，第二阶段扩增的退火温度则固定在61℃。最后的72℃延伸时间为7min。特异性的长度为220bp的PCR产物以1％的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
3、RFLP分析对上述经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物，按照如下反应体系和条件进行限制性内切酶的切割消化10μl的反应体系为3μl的PCR产物，4单位的限制性内切酶BamHI，1μl10×缓冲液和双蒸馏水，37℃恒温过夜。限制性酶切反应终止后，将酶切产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，从而进行基因型判定。基因型区分的依据是220bp的PCR产物以BamH I限制性内切酶消化后，C/C基因型被切割为两条片段，长度分别为197bp和23bp；而基因型T/T则因为没有酶切位点而在消化后只出现220bp一个条带；C/T杂合子经消化后，197bp、23bp和220bp的三个片段均出现。
实施例2该实施例用实施例1建立起来的方法，对1277例持续HBV感染者、748例自限性恢复者和293个核心家系的ESR1基因T29C位点的基因型进行了分析。
1、试验对象2000年2月到2003年5月期间，从解放军307医院、302医院、180医院和重庆西南医院的门诊和病房里收集病例对照人群。按全国病毒性肝炎防治方案(西安，2000)诊断标准，从4112人中筛选出2025名无亲缘关系的持续HBV感染者(病例)、和自限性恢复者(对照)。其中1277名为持续HBV感染者(包括无症状携带者421人，慢性肝炎患者544人和肝硬化患者312人)入选标准为年龄15-75岁，HBsAg阳性6个月以上，排除HCV、HIV共感染。另外748名为自限性恢复者，入选标准为无慢性乙型肝炎病史，HBsAb和HBc IgG同时阳性，排除乙肝疫苗接种史，年龄15-75岁。293个完整的持续HBV感染者核心家系(每一核心家系包括持续HBV感染者及其父母)于2002年1月-2002年7月收集自重庆西南医院感染科。先证者(包括152名无症状携带者，137名慢性肝炎患者，4名肝硬化患者)入选标准为HBsAg阳性6个月以上，排除HCV、HIV共感染。对父母的疾病状态没有限制。样本收集过程按照国家人类基因组研究伦理学准则进行，并获得了被募集对象的知情同意。
2、ESR1基因T29C位点基因型的确定1277例持续HBV感染者和748例自限性恢复对照个体中ESR1基因T29C位点的基因型的频率分布如表1所示29T/T在持续感染者和自限性恢复者的频率分别为41.5％和32.9％；29T/C在持续感染者和自限性恢复者的频率分别为46.8％和51.9％；29C/C在持续感染者和自限性恢复者的频率分别为11.7％和14.2％。以隐性和共显性模型均可得出两组的基因型分布有显著差异(OR值分别为1.41和1.39)。因此，用本发明的方法解析了ESR1的T29C多态性位点与HBV感染后慢性化的易感性的相关性。
表1持续HBV感染者与自限恢复者中ESR1T29C位点基因型的分布
CI可信限。通过执行logistic回归分析检测关联，并校正了年龄和性别的风险因素。性别分层时，logistic回归分析只校正年龄因素。*T/T基因型与T/C+C/C基因型比较；T/T基因型与T/C基因型比较。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但所作改动或修改的等价形式同样落在本申请权利书所限定的范围之内。
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序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所<110>第三军医大学西南医院第一附属医院<120>一种检测与乙肝病毒感染后慢性化相关的易感基因ESR1基因型的方法及ESR1易感基因<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>27<212>DNA<213>
<400>1gaccatgacc ctccacacca aaggatc27<210>2<211>19<212>DNA<213>
<400>2accgtagacc tgcgcgttg 19
权利要求
1.一种通过检测ESR1基因的T29C位点来判定个体对慢性乙肝病毒感染是否易感的方法。其特征在于当某一个体的ESR1基因的T29C位点表现为基因型T/T时，则表明该个体对慢性乙肝病毒感染具有更高的易感性。
2.一种检测ESR1基因的T29C位点的基因型的方法。该方法为PCR-RFLP，即聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性分析方法，其主要特征在于以下关键方面1)对包含T29C多态位点的ESR1基因序列，设计特异性的引物，其序列为正向引物5’-GACCATGACCCTCCACACCAAAGGATC-3’反向引物5’-ACCGTAGACCTGCGCGTTG-3’2)对包含T29C多态位点的ESR1基因区域，以所设计引物，通过热启动和梯度的聚合酶链式反应，以基因特异性引物进行DNA扩增。3)对PCR产物以限制性内切酶BamH I进行切割，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型，以此判明ESR1基因T29C位点的基因型。220bp的PCR产物以BamH I限制性内切酶消化后，若出现长度分别为197bp和23bp的2条带，则为C/C基因型；若只出现220bp一个条带则为基因型T/T；若197bp、23bp和220bp的三个片段均出现则为基因型C/T。
3.一种与慢性乙肝病毒感染易感性关联的ESR1基因T29C位点的检测试剂盒，包括扩增用基因特异性引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种、用于RFLP的限制性内切酶BamHI和相应缓冲液的一种或多种及其酶切图谱。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法或其试剂盒在慢性乙肝病毒感染的人群预防和控制以及遗传咨询中的应用。
全文摘要
本发明涉及与慢性乙肝病毒感染易感性相关的雌激素受体基因ERS1的T29C的一种检测方法，所述方法为PCR－RFLP，即聚合酶链式反应－限制性内切酶长度多态性分析。本发明进一步涉及检测上述易感位点的试剂盒及使用。另外，本发明将雌激素受体基因ERS1的T29C多态位点与慢性乙肝病毒感染的易感性联系起来，确定了ERS1是慢性乙肝病毒感染的一个新型易感基因，为慢性乙肝病毒感染的人群预防和控制提供了新的遗传咨询内容。
文档编号C12Q1/68GK1766124SQ20051008703
公开日2006年5月3日 申请日期2005年7月25日 优先权日2004年8月18日
发明者贺福初, 周钢桥, 王宇明, 邓国宏, 翟芸, 张红星 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院