专利名称：一个用于防治作物病害的编码胞嘧啶脱氨酶的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物病害防治领域，更具体地，本发明涉及一种可用作控制甘蓝黑腐病的编码胞嘧啶脱氨酶的基因。本发明还涉及该基因在植物病害防治中的应用以及作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用。
背景技术：
植物病害一直是农作物减产、品质降低的主要因子之一。随着病原菌对药物抗性的增强，农药用量在不断增加，这不仅加剧了环境污染、药物残留，也大大提高了农业成本，因此，亟待研发新的防病治病策略和新型的无公害药物。弄清植物病原菌侵染寄主的遗传机制是开发新型药物和防病策略的关键。
从寄主中大量掠得能源是植物病原细菌成功侵染的关键。当微环境中嘧啶溃乏时，病原细菌可利用嘧啶补偿途径(Salvage pathways)合成嘧啶，一些动物病原细菌甚至丧失了从头合成途径(De novo pyrimidinebiosynthesis)，专性掠夺寄主的能源合成嘧啶供己所需(Striepen et al，2004)。
胞嘧啶脱氨酶仅存在于细菌和真菌中，真核生物不含有胞嘧啶脱氨酶。胞嘧啶脱氨酶可催化5-氟胞嘧啶(5-FC)转化成尿素和毒性物质5-氟尿嘧啶(5-FU)利用这一特性。利用这一特性，胞嘧啶脱氨酶基因已作为条件自杀基因广泛运用于肿瘤基因治疗(Yi et al，2005；Rehemtulla et al，2004)和植物转基因中(Perera et al，1993)。
甘蓝黑腐病黄单胞菌，也称为甘蓝黑腐病黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris，简称Xcc)，是一种能在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的革兰氏阴性细菌(Qian，2005)。该菌能在寄主的任何生长期通过水孔、气孔或伤口侵入植物体内，引起病害，寄主包括甘蓝、花椰菜、大白菜、萝卜、油菜等。典型的黑腐病症状是在叶缘上形成V字形病斑，随着病斑的扩大，叶脉变黑，因而被称为黑腐病。黑腐病被认为是对十字花科植物危害最为严重的病害，尤其在热带和亚热带地区，温度和湿度都适宜于该菌的生长繁殖，因此发病更加严重。由于遗传稳定性和遗传可操作性，甘蓝黑腐病黄单胞菌一直被用作研究微生物与植物相互作用分子机理的模式细菌。因此，鉴定与黄单胞菌致病相关的新基因，对防治植物病害具有显著的意义。胞嘧啶脱氨酶在嘧啶合成中的作用以及条件自杀基因的特性，具有潜在的靶标特性。
发明内容
本发明鉴定了甘蓝黑腐病黄单胞菌胞嘧啶脱氨酶基因与致病相关，具有条件自杀基因特性，提供可能的防治植物病害的药物靶标。
因此，本发明的一个目的是提供一种编码胞嘧啶脱氨酶的基因(XC1949基因)，其是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1所示的DNA序列；2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
在一个实施方案中，所述的基因具有SEQ ID No.1所示的DNA序列，自5’端的第206-718位核苷酸为开放阅读框。
本发明还涉及含有上述基因的表达载体。优选为pCXC1949。
本发明另一个目的是提供上述基因在植物病害防治中的应用。
在本发明的一个实施方案中，所述植物病害是由甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)所导致的甘蓝黑腐病。
本发明还有一个目的是提供所述的基因作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用。在一个实施方案中，所述植物病害是由甘蓝黑腐病黄单胞菌所导致的甘蓝黑腐病。
SEQ ID No.1所示的DNA是甘蓝黑腐病黄单胞菌8004菌株的DNA，由927个碱基组成。含完整的胞嘧啶脱氨酶基因，自5’端的第206-718位核苷酸为该基因的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第206-208位核苷酸为该基因的起始密码子GTG，自5’端的第719-721位核苷酸为终止密码子TGA。
SEQ ID No.2所示的蛋白质是胞嘧啶脱氨酶基因编码的胞嘧啶脱氨酶产物，由171个氨基酸组成。该蛋白质预测分子量为18635.37道尔顿，等电点为6.79。
含有本发明开放阅读框及其部分序列的表达载体均属于本发明的保护范围。
图1为XC1949基因的克隆酶切电泳图谱。1100bp标准DNA(片段大小从大到小依次为3kb，2kb，1.5kb，1.2kb，1kb，0.9kb，0.8kb，0.7kb等)；2XC1949基因片段；3λ/HindIII2标准DNA(片段大小从大到小依次为23.1kb，9.4kb，6.6kb，2.4kb，2.0kb)。
图2为XC1949基因插入突变体118H11的PCR验证凝胶图。1100bp标准DNA；2XC1949基因插入突变体118H11。
图3为XC1949基因插入突变体118H11的胞嘧啶脱氨酶表型检测。AXC1949基因插入突变体118H11；B野生型。
图4为XC1949基因插入突变体118H11的致病性试验。
A为甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型菌株8004；B为XC1949基因插入突变体118H11；C为水(空白对照)。
具体实施例方式
下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例在本发明的实施例中所用到的材料包括甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型菌株8004，购于英国植物病原细菌国家保藏中心(The National Collectionof Plant Pathogenic Bacteria，NCPPB)，保藏号为NCPPB No.1145。大肠杆菌(Escherichia coli)株系JM109、载体pGEM-3Zf(+)购自Promega公司，pLAFR3、pLAFRJ为本研究室保存的柯斯质粒(Staskawicz et al，1987)；限制性内切酶、修饰酶等试剂购自Promega、Stratagene、QIAGEN公司；5-氟胞嘧啶(5-FC)购自上海三维制药有限公司和南通制药总厂。
实施例1 甘蓝黑腐病黄单胞菌突变体库的构建以大肠杆菌和Xcc之间的穿梭质粒pLAFR1为载体将Tn5gusA5(Sharma，1991)引入Xcc野生型菌株8004，然后通过引入不相容质粒pPH1JI(Tang et.al，2005)驱赶pLAFR1，通过抗生素(卡那霉素)抗性标记筛选Xcc::Tn5gusA5插入突变体，结合Xcc全基因组序列(基因组序列号NC 007086)和TAIL-PCR(Thermal Asymetric Interlaced-PCR)(Yao-Guang Liu，1995)技术，确定Tn5gusA5在基因组上的插入位置，并对插入位置进行PCR验证。通过考察突变体的致病性、胞外酶活性、胞外多糖合成等表型的变化，筛选致病相关基因(Tang et.al，2005)，本发明涉及其中一个新的致病相关基因-XC1949基因(胞嘧啶脱氨酶基因)，其插入突变体编号为118H11，筛选过程见参考文献(Tang et.al，2005)。
实施例2 XC1949基因(胞嘧啶脱氨酶基因)的克隆及序列测定根据XC1949的基因序列(见序列表SEQ ID No.1，第1位到第927位碱基)，设计引物(上游引物GGGAATTCATCGCGGCGTGTTTTTGACCCC和下游引物GGTCTAGACTCGGCGAGCACGTTCAACTGC；PCR条件95℃3min；95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃5min))，以甘蓝黑腐病黄单胞菌8004菌株总DNA为模板，用PCR法扩增该基因全长序列，并将其克隆至克隆载体pGEM3Zf(+)中，用双脱氧核苷酸法在ABI 377 DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列(SEQ ID No.1)。将测序验证正确的XC1949基因序列克隆至穿梭载体pLAFRJ中，获得了含该基因的重组质粒pCXC1949。该质粒用EcoRI、XbaI酶切，除了一个22kb的载体条带外，还有一个927bp的外源片段(见图1)。
实施例3 XC1949基因插入突变体118H11的验证对插入突变体118H11进行TAIL-PCR测序定位，发现其插在XC1949基因内。用转座子Tn5上gus侧的一条引物(TTGTAACGCGCTTTCCCACCAACGC)和上游基因XC1948的一条引物(5’-GGGCAAGAGCGAAAAGCTGGACG-3’)配对进行PCR验证(95℃3min；95℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，30个循环；72℃5min)，产物预期大小788bp(见图2)。
实施例4 XC1949基因插入突变体118H11的胞嘧啶脱氨酶活性检测在不含氮源的基本培养基(Minimal Medium for Xanthomonas，简称MMX)(每升含葡萄糖5.0g，柠檬酸三钠1g，磷酸氢二钾4g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁0.2g，pH7.0)平板上加入终浓度为250μg/ml的5-氟胞嘧啶，然后用牙签点接甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型8004菌株、突变菌株118H11于平板表面，28℃培养72小时。结果表明，XC1949基因插入突变体能够正常，表明胞嘧啶脱氨酶活性丧失；而野生型黄单胞菌由于具有胞嘧啶脱氨酶活性，将5-氟胞嘧啶转化成毒性物质5-氟尿嘧啶，导致其不能正常生长(见图3)。
实施例5.XC1949基因插入突变体118H11的致病性检测实验所用寄主植物为萝卜苗(种名为Raphanus sativus L.var.radiculusPers.)，所用的接种方法为剪叶法。XC1949基因插入突变体和野生型菌株在28℃下进行液体培养(MMX)，15-18个小时。用丰富培养基NYG(每升溶液含5g蛋白胨，3g酵母膏和20g甘油，根据三组分缩写为NYG)稀释到OD600＝0.001，用灭过菌的剪刀在菌液浸泡5秒钟后，在健康叶片距叶尖1-2cm垂直叶脉的方向剪到中轴处，停留5秒钟，被接种的植物在25-30℃培养一周后观察结果，正对照选用甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型8004菌株，负对照用清水。致病试验表明，XC1949基因的插入突变体的致病性显著降低(见图4)。
从本实施例可以看出，本发明要求保护的基因的失活直接导致甘蓝黑腐病黄单胞菌致病力的下降。因此，本发明要求保护的基因可以用于植物病害防治，特别是由甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)所导致的甘蓝黑腐病。另外，本发明要求保护的基因可以作为开发用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员根据本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是甘蓝黑腐病的药物。
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序列表<110>广西大学<120>一个用于防治作物病害的编码胞嘧啶脱氨酶的基因<130>IB055876<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>927<212>DNA<213>Xanthomonas campestris pv.campestris<400>1atcgcggcgt gtttttgacc ccggccggcg aagcgctggc ggcctccagc cggcagcggc60accagatcgt cgagcgcttc ctgcttgcgc tgggtatcga cgaggccacc gcgcggcgtg120acgccgaagg catcgaacac cacgtcagcg aagccaccgt cgccgctttt gccgcgttcc180tggaacggca gggcaacagc accccgtgag cgtgtcgccc gatcaccacg cgcaagacgc240acacctgcaa atcgaccagc aatggatgac tcacgccttg cggctggccg aacgtgccga300gcgggactat gacgagattc cggtcggcgc ggtgctggtg gatccaaccg gcgcgctgct360cggcgagggc tggaacttca acatcgccag ccacgacccc agtgcgcatg ccgagatcat420ggccatgcgc gaaggcggcc ggcggctggc caaccaccgc ctgatcggct gcacgctgta480cgtgacgttg gagccgtgtg caatgtgcgc catggcgatg atccatgcgc gcattgcgcg540ggtggtgttc gccgccagcg accccaagac cggcgcctgc ggcagcgtgt tcgacctgct600cgccgaccca cgccacaacc atcgcgtgca ggtcagcggc ggggtgctgg ccgccgaggc660cgggctgcgc ctgaccaatt actttcgcgc caagcgtggc aagccgccgc tcgtgccctg720atcggcatgg ccgcggtatg atgcgcgccc tttcagcacc cggccggcaa cggccctcca780caggacggtg atatggcaga caacgttgcg ggcaacgacc gactgatctg gatcgatctg840gaaatgaccg gcctggatac cgatcgcgat tcgatcatcg agatcgccac catcgtgacc900gatgcgcagt tgaacgtgct cgccgag927<210>2
<211>171<212>PRT<213>Xanthomonas campestris pv. campestris<400>2Met Ser Val Ser Pro Asp His His Ala Gln Asp Ala His Leu Gln Ile1 5 10 15Asp Gln Gln Trp Met Thr His Ala Leu Arg Leu Ala Glu Arg Ala Glu20 25 30Arg Asp Tyr Asp Glu Ile Pro Val Gly Ala Val Leu Val Asp Pro Thr35 40 45Gly Ala Leu Leu Gly Glu Gly Trp Asn Phe Asn Ile Ala Set His Asp50 55 60Pro Ser Ala His Ala Glu Ile Met Ala Met Arg Glu Gly Gly Arg Arg65 70 75 80Leu Ala Asn His Arg Leu Ile Gly Cys Thr Leu Tyr Val Thr Leu Glu85 90 95Pro Cys Ala Mer Cys Ala Met Ala Mer Ile His Ala Arg Ile Ala Arg100 105 110Val Val Phe Ala Ala Ser Asp Pro Lys Thr Gly Ala Cys Gly Ser Val115 120 125Phe Asp Leu Leu Ala Asp Pro Arg His Asn His Arg Val Gln Val Ser130 135 140Gly Gly Val Leu Ala Ala Glu Ala Gly Leu Arg Leu Thr Asn Tyr Phe145 150 155 160Arg Ala Lys Arg Gly Lys Pro Pro Leu Val Pro165 170
权利要求
1.一种编码胞嘧啶脱氨酶的基因，其是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1所示的DNA序列；2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于它具有SEQ ID No.1所示的DNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于自5’端的第206-718位核苷酸为开放阅读框。
4.含有根据权利要求1或2所述的基因的表达载体。
5.根据权利要求4的表达载体，其为pCXC1949。
6.权利要求1或2所述的基因在植物病害防治中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中所述植物病害是由甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)所导致的甘蓝黑腐病。
8.权利要求1或2所述的基因作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述植物病害是由甘蓝黑腐病黄单胞菌所导致的甘蓝黑腐病。
全文摘要
本发明公开了来自甘蓝黑腐病黄单胞菌中的一个与致病相关的基因(胞嘧啶脱氨酶基因)。本发明所提供的胞嘧啶脱氨酶基因，其是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1所示的DNA序列；2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。本发明还涉及该基因在植物病害防治中的应用以及作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用。
文档编号C12N15/63GK1952153SQ20051008665
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月20日 优先权日2005年10月20日
发明者唐纪良, 姜伯乐, 梁晓夏, 何勇强, 唐东阶, 冯家勋, 陈保善 申请人:广西大学