专利名称：：一种防治作物真菌病害的大环内脂类组合物及其制备工艺的制作方法
技术领域：
：本发明属于农药生产
技术领域：
，特别是涉及一种防治作物真菌病害的农用抗生素制备工艺和用途。
背景技术：
：当前，人类对环境的要求越来越严格，而化学农药的开发难度也越来越大，成功率越来越低。经过几十年的筛选，几乎已遍及了人们可想象的化学结构。为此，世界工业发达国家及各大农药公司纷纷寻找新的开发点，同时也为了寻找新的先导化合物，农药的研究开发进入了回归自然的时代，即从天然产物中寻找可开发的农药或先导化合物。由于天然产物在分子大小与性质等方面已经过长期与生物分子相互作用的进化选择，因而具有良好的类药性；另外，作为生态系统的一部分，天然产物具备一种特别的优势环境的适应性和兼容性。如何从天然产物中寻找新农药化合物或先导化合物，已成为当今农药开发的主题之一。大量研究表明，通过生物合成的微生物次生代谢产物的化学结构极其复杂和多样化，它们不仅以独特的作用机理作用于靶标生物，而且具有内在的生物可降解性，低残留的明显优势，在有效防治作物病害的同时对非靶标生物的副作用较小。因此可以从微生物次生代谢产物中开发出高效的杀菌剂，以克服由许多老品种化学合成杀菌剂引致的抗性和污染问题。目前国内外已成功开发出各种微生物源的农用杀菌剂，例如灭瘟素S，春雷霉素，多抗霉素，有效霉素、米多霉素、硝吡咯菌素和嗜球果伞素等，用于防治植物真菌病害。另外，微生物源的抗真菌物质还可以作为合成高活性类似物的先导化合物，例如分别以硝吡咯菌素及嗜球果伞素作为先导化合物，合成出活性更高的拌种咯和氟咯菌腈，以及嘧菌酯和甲基醚菌酯，并且都已成功上市。近来，不断有新的抗生素化合物从各种微生物次生代谢产物中分离到，如gopalamicin和thiobutacin等，可用于防治某些作物病害。另外，持续增长的天然化合物数量表明，自然界中多样性的巨大潜力还远未发掘完。放线菌是各种抗生素的最丰产微生物，它产生如氨基糖苷、蒽环、糖肽、13-内酰胺、大环内酯、核苷、肽、多烯和聚醚等作用机理独特与结构多样化的抗生素，其产生的抗生素占天然抗生素的75%以上。尤其值得注意的是，链霉菌产生的新抗生素在数量和结构多样性方面均超过放线菌的其它属，特别是在农业上使用的抗生素中，约60%分离自链霉菌，表明链霉菌拥有更强的新抗生素合成能力。本发明就是在此背景下创制的。
发明内容1.发明目的本发明提供一种有效成分为阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素组合物的杀真菌农用抗生素，命名为WYLZ-1349，并提供一种从链霉菌属的微生物中发酵、分离、提取阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素组合物，再添加适当的稳定剂和助剂制备成杀真菌农用抗生素产品的方法，以及利用该产品进行防治作物真菌病害的应用，从而开发出一种稳定性好、高效、安全低毒的新农药。本发明人为了寻找比以往更有效的杀真菌农用抗生素，从土壤中分离各种微生物来筛选微生物次生代谢产物，然后对这些次生代谢产物分别进行精制、鉴定和开发应用。在此过程中，本发明人发现属于链霉菌属的马来西亚链霉菌(Str印tomycesmalaysiensis)ECO00002所产生的次生代谢产物对多种作物病害有良好的防治效果，通过对有效成分的精制、鉴定，并与文献报道的相关化合物的谱图数据相比较，发现有效成分中3个主要活性成分的平面结构与文献报道的阿扎霉素F3(AzalomycinF3)、阿扎霉素F4(AzalomycinF4)和尼菲霉素(Niphimycin)相同(Chem.Pharm.Bull.，1967,15:1657-1661，1726-1732;1982,30:1653-1657，1658-1668，1669-1673，4006-4014.J.Antibiot.，1970,23:107-112;1981,34:1107-1118;1982,35:1480-1494;1984,37:103-109，1167-1169，1170-1186;1985,38:1363-1369;1986,39:713-716;1990,43:639-647;1993,46:1912-1915;1994，47:688-696;1995,48:293-299，896-898，1173-1175，1350-1352;1996,49:765-769;1997，50，194-200，484-489，965-969.J.BasicMicrobiol.，1998，38:415-419.J.Am.Chem.Soc.，1982，104:4129-4141)，均为36元环大环内脂类化合物。2.技术方案本发明是通过以下技术方案来实现的。WYLZ-1349的制备工艺、活性成分的精制与鉴定方法，其特征在于按如下步骤依次进行(1)种子培养过程采用马来西亚链霉菌(Str印tomycesmalaysiensis)ECO00002，保藏登记入册编号为CGMCCNo.1680，在种子罐中加入下列成分，按重量百分含量计酵母膏0.40.8，葡萄糖0.41.O，麦芽膏1.02.O，复合维生素0.0010.002，微量盐0.0050.01，以及0.051.0%(V/V)有机硅消泡剂，其余含量为水，12rC高压灭菌40分钟后备用。培养条件在种子罐中培养3648小时，培养温度为2632°C，pH6.57.0，通气量1:(0.50.8)(V/V)，罐压0.030.05Mpa，搅拌速率100150转/分钟。(2)抗生素发酵过程在发酵罐内加入下列成分，按重量百分含量计甘露醇2.03.O，大豆粉2.04.O，磷酸氢二钾0.01%以及0.051.0%(V/V)有机硅消泡剂，其余含量为水。在上述物料放入发酵罐后，灭菌前调整pH值为7.5，12rC高压灭菌40分钟备用。将步骤(1)培养好的种子液接入发酵罐，上罐接种量为10%20%(V/V)。培养条件培养时间7296小时，培养温度为2632。C，pH6.57.O，通气量1:(0.51.0)(V/V)，罐压0.030.05Mpa，搅拌速率100-200转/分钟。(3)发酵产物后处理，按以下步骤依次进行A.将发酵液进行过滤，过滤得上清液和菌丝体；B.将菌丝体放入提取罐中，加入丙酮或甲醇等有机溶剂搅拌破壁610小时后，过滤得菌丝体的提取液；C.将菌丝体的提取液抽入到浓縮罐中，在700mmHg真空度，蒸气压0.02MPa，温度203(TC条件下减压浓縮回收丙酮；待丙酮回收完后，将菌丝体的提取清液与步骤A.所得的上清液一起采用大孔吸附树脂吸附，用丙酮或甲醇等有机溶剂洗脱，含活性组分的洗脱液经浓縮后得到WYLZ-1349的粗提物；D.在粗提物中加入适当比例的各种农药通用载体或助剂后得成品WYLZ-1349。(4)WYLZ-1349中活性成分的精制与鉴定取步骤(3)中步骤C.得到的部分粗提物经过硅胶及S印hadexLH-20凝胶柱层析，可得到半精制品。然后运用高效液相色谱制备分别得到3个主要活性成分的纯品，纯度可达98-99%。分别测定这3个主要活性成分纯品的一维(力、13〇NMR)和二维(HMQC、C0SY、HMBC、R0ESY和HMQC-TOCSY)核磁共振波谱、质谱(MS)、红外光谱(IR)和紫外光谱(UV)，以及熔点、旋光和溶解性等理化常数。通过详细分析各种谱图数据，并与文献报道阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素的谱图数据相比较，确定这3个主要活性成分即阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素，其分子式分别为C56H95N3017、C57H97N3017和C59H103N3018，分子量分别为1082.36、1096.39和1142.46，推定其分别具有如下的平面结构R=H，阿扎霉素F3尼菲霉素R=CH3，阿扎霉素F4阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素属于具有胍基及丙二酸基的36元环大环内脂类结构的杀真菌农用抗生素，其理化性质分别见表1表3，核磁共振分析数据分别见表4表6。表1阿扎霉素F3的理化性质<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表5阿扎霉素F4的^、"C核磁共振分析数据(溶剂甲醇_d4)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表6尼菲霉素的^、"C核磁共振分析数据(溶剂甲醇_d4)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>所述的WYLZ-1349的制备工艺，其特征在于由种子罐接入发酵罐的接种量为10%20%(V/V);菌株在种子罐的培养时间为3648小时；种子罐和发酵罐中均加入0.051.0%(V/V)有机硅消泡剂。所述的WYLZ-1349中活性成分的的精制与鉴定方法，其特征在于WYLZ-1349中3个主要活性成分阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素的分子式分别为C^ft^0『(^H^NA7和C^H皿N^8，分子量分别为1082.36、1096.39和1142.46，分别具有如下的平面结构:R=CH3,阿扎霉素F4所述的WYLZ-1349的制备工艺，其特征在于阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素组合物用于防治作物真菌病害。3.优点及效果本发明采用的发酵培养基配方简单，原料来源稳定，且成本低，适合大规模工业化生产。在保证原料稳定的同时，可以通过严格控制各项发酵参数来控制成品的质量，从而形成科学完整的质量体系。本产品不剌激皮肤、眼等，对人、畜无毒害；对农作物无药害，耐雨水冲刷；对光、热稳定。本产品防治作物真菌病害效果明显。具体实施例方式实施例1—种可产生杀真菌农用抗生素的菌株，其学名为马来西亚链霉菌(Str印tomycesmalaysiensis)ECO00002，该菌株已于2006年4月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记入册编号为CGMCCNo.1680。该菌株细胞壁含有L，L-二氨基庚二酸，全细胞糖水解物含有半乳糖和阿拉伯糖，胞壁I型。该菌株在高氏一号、甘油-天门冬酰胺、酵母膏-麦芽膏、燕麦片、马铃薯浸汁和营养琼脂培养基上生长良好；在高氏一号琼脂培养基上的形态特征为菌落白色，圆形，表面毛绒状，边缘有较多菌丝生长；基内菌丝和气生菌丝为丝状，不规则分支，一般不断裂；气生菌丝上形成长孢链，直形、波形或螺旋形，孢子圆形、椭圆形至杆状。该菌株在蛋白胨-明胶培养基上能液化明胶，凝固牛奶，对硝酸盐还原及脲的利用呈阳性，能水解淀粉，纤维素上不生长，不产生硫化氢及黑色素，能利用葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇、甘油、草酸钠、乙酸钠和柠檬酸。WYLZ-1349的制备工艺、精制与鉴定方法，按如下步骤依次进行(1)种子培养过程采用马来西亚链霉菌(Str印tomycesmalaysiensis)EC000002，在种子罐中加入下列成分，按重量百分含量计酵母膏0.4，葡萄糖0.4，麦芽膏1.0，复合维生素0.001，微量盐0.005，以及0.05%(V/V)有机硅消泡剂，其余含量为水，12rC高压灭菌40分钟后备用。培养条件在种子罐中培养48小时，培养温度为28士rC，pH6.57.O，通气量1:0.6(V/V)，罐压0.03Mpa，搅拌速率120转/分钟。(2)抗生素发酵过程在发酵罐内加入下列成分，按重量百分含量计甘露醇2.0，大豆粉2.0，磷酸氢二钾0.01%以及0.05%(V/V)有机硅消泡剂，其余含量为水。在上述物料放入发酵罐后，灭菌前调整pH值为7.5，12rC高压灭菌40分钟备用。将步骤(1)形成的种子液接种入发酵罐，接种量为15%(V/V)。发酵时罐压控制在0.03Mpa，通气量1:0.5(V/V)，培养温度为28士rC，搅拌速率180转/分钟，培养时间72小时。(3)发酵产物后处理，按以下步骤依次进行A.将发酵液进行过滤，过滤得上清液和菌丝体；B.将菌丝体放入提取罐中，加入75%的丙酮_水(V/V)溶液搅拌6小时，过滤得菌丝体的提取液；C.将菌丝体的提取液抽入到浓縮罐中，在700mmHg真空度，蒸气压0.02MPa，温度203(TC条件下减压浓縮回收丙酮；待丙酮回收完后，将菌丝体的提取清液与步骤A.所得的上清液一起采用大孔吸附树脂吸附，40%丙酮-水(V/V)洗脱，含活性组分的洗脱液经浓縮后得到WYLZ-1349的粗提物I;D.取50份粗提物I与4份拉开粉、2份浸润剂LS以及56份硅藻土混合、粉碎，即得100份所需含量的可湿性粉剂。(4)WYLZ-1349中活性成分的精制与鉴定取步骤(3)中步骤C.得到的200克粗提物1经过硅胶柱层析，85%氯仿-甲醇(V/V)洗脱，收集活性组分，经浓縮后得到60克黄色粉末II;取20克II经过S印hadexLH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱，收集活性组分，经浓縮后得到7克浅黄色粉末III;取200毫克III，运用Waters1525高效液相色谱制备，色谱柱HederaODS-P(250X20mm，5iim)，流动相:75%甲醇-水(V/V)，流速10.0毫升/分钟，检测波长233纳米，分别收集保留时间为22.47分钟、26.20分钟和33.84分钟的单峰，经浓縮后分别得到32毫克、29毫克和43毫克纯度为99%的IV、V和VI纯品。测定IV、V和VI纯品的一维(力、13〇NMR)和二维(HMQC、COSY、HMBC、ROESY和HMQC-TOCSY)核磁共振波谱、质谱(MS)、红外光谱(IR)和紫外光谱(UV)，以及熔点、旋光和溶解性等理化常数。通过详细分析各种谱图数据，并与文献报道阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素的谱图数据相比较，确定IV、V和VI分别为阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素，其分子式分别为C56H95N3017、C57H97N3017和(^H皿NA8，分子量分别为1082.36、1096.39和1142.46，分别具有如下的平面结构R=H，阿扎霉素F3尼菲霉素R=CH3，阿扎霉素F4实施例2将按实施例1所制备的WYLZ-1349成品稀释至50200毫克/升，分别用三环唑(75%可湿性粉剂)、菌核净(40%可湿性粉剂)、扑海因(50%可湿性粉剂)和百菌清(75%可湿性粉剂)作为对照药剂，清水作为空白对照，试验WYLZ-1349成品对水稻稻瘟病、烟草赤星病、番茄灰霉病和辣椒炭疽病的防治效果，试验结果表明WYLZ-1349可有效防治水稻稻瘟病、烟草赤星病、番茄灰霉病和辣椒炭疽病，用药剂量明显低于对照药剂。试验结果见表7表10。表7WYLZ-1349防治水稻稻瘟病试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表8WYLZ-1349防治烟草赤星病试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表9WYLZ-1349防治番茄灰霉病试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表10WYLZ-1349防治辣椒炭疽病试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>权利要求一种农用杀菌剂，其特征在于它是以阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素组合物为有效成分的杀菌剂WYLZ-1349，阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素的分子式分别为C56H95N3O17、C57H97N3O17和C59H103N3O18，分子量分别为1082.36、1096.39和1142.46，分别具有如下的平面结构R＝H，阿扎霉素F3尼菲霉素R＝CH3，阿扎霉素F4产生WYLZ-1349所用的菌株是马来西亚链霉菌(Streptomycesmalaysiensis)ECO00002，保藏编号为CGMCCNo.1680。F2008102334355C0000011.tif2.权利要求l所述农用杀菌剂的制备方法，其特征在于先培养马来西亚链霉菌(Str印tomycesmalaysiensis)ECO00002，再分离提取发酵培养物，用丙酮或甲醇将菌丝体破壁后，与发酵上清液合并，经大孔吸附树脂吸附分离，并用丙酮或甲醇洗脱，洗脱液浓縮或进一步纯化得新磷氮霉素，再添加载体或助剂后得成品。3.权利要求1所述农用杀菌剂的应用，其特征在于所述杀菌剂可防治下列作物真菌病害水稻稻瘟病、烟草赤星病、番茄灰霉病和辣椒炭疽病。TR=H，阿扎霉素F3尼菲霉素全文摘要本发明提供一种以阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素组合物为有效成分的农用杀菌剂WYLZ-1349及其制备方法和应用。该杀菌剂的制备方法包括先培养保藏编号为CGMCCNo.1680的马来西亚链霉菌(Streptomycesmalaysiensis)ECO00002，再分离提取发酵培养物，用丙酮或甲醇将菌丝体破壁后与发酵上清液合并，经大孔吸附树脂吸附分离，并用丙酮或甲醇洗脱，洗脱液浓缩或进一步纯化得WYLZ-1349或阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素，再添加载体或助剂后得成品。试验结果表明，该杀菌剂特别对防治水稻稻瘟病、烟草赤星病、番茄灰霉病和辣椒炭疽病有良好的效果。与现有药剂相比，具有用量少、农民使用成本低、使用范围广等优点。文档编号C12R1/465GK101720772SQ20081023343公开日2010年6月9日申请日期2008年10月13日优先权日2008年10月13日发明者尚慧,文孟良,李家瑞,李铭刚,杨佩文,赵江源申请人:云南大学;云南省农业科学院