专利名称：一种防治作物土传病害生防菌剂的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生防菌剂，特别是一种用于防治作物土传病害的木霉菌生物农药的制备方法及其与化学杀菌剂恶霉灵的协同应用。
背景技术：
随着越来越多有毒化学农药逐渐被限制使用，世界各国都在加大生物农药的研发力度，研制、开发微生物农药已成为势在必行。木霉摄iTrichoderma ririofe)作为一类有重要生防价值的拮抗性真菌，早在20世纪30年代就已经发现对植物病原真菌有拮抗作用，其作用机制包括产生抗生素、重寄生作用、溶菌作用、竞争作用等。木霉菌强烈的竞争及生存能力在抑制病原菌尤其是土传病害的过程中起着重要作用，是一种很有开发利用价值的生防菌。目前国际上已开发注册有木霉菌产品，但由于诸如产品性能不稳定，孢子寿命短、生防活性低等各种技术原因，尤其是施入土壤后受到各种化学因子的影响使之不能在作物根部定植形成有效群体，影响了该类产品在生产上的应用。近年韩国学者通过提取和分离土壤中有益微生物和在土壤中添加营养物质以改善农作物种植的土壤环镜，抑制土壤中致病菌；加拿大学者利用多种化学和生物处理方法协同改善农田土壤环境，防治土传病害。国内已有研究表明木霉菌与化学杀菌剂三唑酮配合使用可提高西瓜根际木霉菌的种群数量，并削弱根际尖孢镰刀菌。本实验室多年的研究也表明木霉菌与某些低剂量杀菌剂如敌克松、五氯硝基苯结合使用，不仅有助于保持或增强生防菌的竞争活力，同时可削弱病菌的侵染活性，产生明显的协同增效作用。杀菌剂恶霉灵高效、低毒、无公害，对人、畜、鱼、鸟类均有较好的安全性，能抑制许多植物病原真菌菌丝体的正常生长或直接杀灭病菌，又能促进植物生长。为目前生产上防治土传病害的高效杀菌剂，对土壤真菌包括镰刀菌、丝核菌、腐霉菌、柱孢菌、伏革菌等病原菌引起的多种作物枯萎病、立枯病、猝倒病、菌核病、烂秧及怄根等连作重茬障碍有特效。经本发明多年试验研究发现，恶霉灵在正常田间使用浓度范围内对木霉菌具有刺激生长作用，且可促进作物根系发育，利用恶霉灵对生防木霉菌的敏感性差异与木霉菌协同施用，将成为提高作物土传病害防治效果的重要手段，可解决木霉菌生物防治作用不稳定之不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于防治作物土传病害的木霉菌生防菌剂的制备方法及其与杀菌剂的协同应用技术。与其它发明不同的是，本发明木霉菌制剂除可直接用于防治作物土传病害外，还可与杀菌剂恶霉灵协同应用。本发明通过多年大量研究发现大多数木霉菌具有强烈的竞争生存能力及对土壤中病原菌的重寄生作用，而恶霉灵对大多数木霉菌具有刺激生长作用，木霉菌生防制剂与恶霉灵同时施用具有协同增效作用。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的:
所采用的生防菌取自作物根表土壤的木霉菌，经纯化后转移至试管斜面内作母菌剂，在三角瓶内振荡培养为液体菌种，再与营养基质草炭粉、秸杆粉、树叶粉及孢子生长促进剂进行固体发酵使其产生分生孢子，将载有大量木霉菌孢子的发酵产物与载体混合后制成木霉菌生防制剂，在田间可与杀菌剂恶霉灵同时施用具有显著协同增效作用。所述防治作物土传病害生防菌剂按如下步骤制备而成:
1、斜面母菌种的制备:取作物根表土壤5-10克，加无菌水1000倍成稀释液；
取马铃薯150-200克、葡萄糖15-20克、孟加拉红0.04-0.07克、硫酸链霉素0.03-0.04克、恶霉灵0.1-0.2克、琼脂17-20克、水1000毫升制成菌种培养液；将稀释液与菌种培养液按1: 9的重量比例一起倒入培养皿内制成平板，25-28°C下培养48小时，经分离获得木霉菌菌株，经纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种；
2、二级菌种的制备:取马铃薯150-200克、葡萄糖或蔗糖15-20克、水1000毫升，配制成二级发酵培养液，调PH值为6-8，分装在250-500毫升三角瓶中，装液量为100-200毫升，在121°C下灭菌30-40分钟，接入斜面母菌种，摇床转速为150-200转/分，发酵温度26-30°C，发酵时间为2-4天，得到大量发散的絮状菌丝及分散的分生孢子二级菌种；
3、固体发酵:所采用的固体发酵培养基成分为:培养料草炭或秸杆粉或树叶粉28-40克、稻壳10-12克、水50-60克、磷酸二氢钾0.1-0.2克、硫酸镁0.1-0.2克、硫酸钙0.1-0.2克；先将无机盐溶入水中，再将培养料与水充分混合后制成固体发酵培养基，固体发酵培养基装入耐高温塑料袋或发酵瓶中，在120°C下灭菌70-90分钟，接入重量比例5-10%的二级菌种，控制发酵温度为25-30°C，发酵时间4-6天，至培养料变成绿色即木霉菌分生孢子；
4、作物土传病害生防菌剂的制备:将满载木霉菌孢子的固体培养料经常温干燥后，用万能粉碎机粉碎成高浓度木霉菌孢子粉，取重量比例为30-49.99%孢子粉与重量比例为50-69.99%轻质碳酸钙或硅藻土，再加入重量比例为0.01%的恶霉灵作为增效剂，充分混合后制成木霉囷 制剂。5.生防菌剂的应用:将木霉菌生防菌剂200-400倍用于防治作物土传病害，并可与杀菌剂恶霉灵4000-5000倍协同施用。施用方法为床面拌土或浸蘸种苗或生长期灌根。本发明的优点在于:
1.从作物根表得到木霉菌菌株经发酵制成孢子制剂，制作方法简单，
适合于不同规模生产。2.木霉菌固体发酵原料为草炭粉、秸杆粉和树叶粉，来源丰富，价格低廉，同时又是设施蔬菜栽培及防治由尖孢镰刀菌为主的土传病害引起的连作障碍的土壤改良剂，与木霉菌混合培养制成生防制剂施入土壤，既有利于改善土壤环境，又有利于菌丝在土壤中的伸展蔓延，在木霉菌大量繁殖的过程中抑制土壤致病菌的生长，同时解决土传病和连作障碍问题。3.本发明制备的木霉菌生防制剂可与杀菌剂恶霉灵复合施用，二者具有显著协同增效作用，可防治多种作物土传病害。恶霉灵是一种内吸性杀菌剂、同时又是一种土壤处理齐U、植物生长调节剂，其作用机理独特，并具有促进作物根系生长发育、生根壮苗作用。木霉菌与恶霉灵结合既能抑制病原菌萌发，又能促进根系生长，有利于木霉菌在作物根系的繁衍，具有防病增产的双重功能。按照本发明提供的木霉菌，通过人工培养后又施入于作物根围，并随着根系的生长在土壤进一步繁衍，形成有益木霉菌在土壤中的良性循环，与恶霉灵一起达到对土传病害的持续控制，无残留，无污染，对大棚黄瓜、西瓜、甜瓜及棚下人参、西洋参等土传病害防治效果达78%以上。本发明适用于大多数木霉菌株，制作方法简单，省水省电，适合于不同规模生产，市场前景广阔。
具体实施例方式以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。实施例1
1.斜面母菌种的制备:取作物根表土壤5克，加无菌水5千克制成稀释液；取马铃薯150克、葡萄糖20克、孟加拉红0.04克、硫酸链霉素0.03克、恶霉灵0.1克、琼脂20克、水1000毫升制成菌种培养液；将稀释液与菌种培养液按1: 9的重量比例一起倒入培养皿内制成平板，25°C培养48小时，经分离获得木霉菌菌株，经纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种；
2.二级菌种的制备:取马铃薯150克、葡萄糖或蔗糖20克、水1000毫升，配制成二级发酵培养液，调PH值为6，分装在250毫升三角瓶中，装液量为100毫升，在121 °C下灭菌30分钟，接入斜面母菌种，摇床转速为150转/分，发酵温度26°C，发酵时间为4天，得到大量发散的絮状菌丝及分散的分生孢子二级菌种；
3.固体发酵:所采用的固体发酵培养基成分为:培养料为草炭或秸杆粉或树叶粉40克、稻壳10克、水50克、磷酸二氢钾0.1克、硫酸镁0.2克、硫酸钙0.15克；制作方法是先将无机盐溶入水中，再将培养料与水充分混合后制成固体培养基，装入耐高温塑料袋或发酵瓶中，在120°C下灭菌70分钟，接入重量百分比为5%的二级菌种，控制发酵温度为25°C，发酵时间6天，至培养料变成绿色即木霉菌分生孢子；
4.生防菌剂的制备:将满载 木霉菌孢子的固体培养料经常温干燥后，用万能粉碎机粉碎成高浓度木霉菌孢子粉，取重量比例为30%孢子粉与重量比例为69.99%硅藻土，再加入重量比例为0.01%的恶霉灵作为增效剂，充分混合后制成木霉菌制剂。用于黄瓜枯萎病防治结果表明:在黄瓜播种时以木霉菌制剂200倍拌土、与恶霉灵4000倍拌土同时施用，装营养钵育苗，4叶期再以木霉菌制剂200倍兑水、与恶霉灵4000倍兑水同时施用灌根一次，并分别以单用木霉菌制剂和恶霉灵做对照，其防治效果分别为94.23%,79.34%和76.6%,复合处理比单独处理增加防效14.89%和17.63%。用于西瓜枯委病防治结果表明:在西瓜播种时以木霉囷制剂200倍祥土与恶霉灵4000倍拌土同时施用，装营养钵育苗，4叶期再以木霉菌制剂200倍兑水、与恶霉灵4000倍兑水同时施用灌根一次，并分别以单用木霉菌制剂和恶霉灵做对照，其防治效果分别为88.45%,76.67%和79.53%,复合处理比单独处理增加防效11.78%和8.92%。实施例2
1.斜面母菌种的制备:取作物根表土壤7.5克，加无菌水7.5千克，制成稀释液；取马铃薯175克、葡萄糖17.5克、孟加拉红0.05克、硫酸链霉素0.035克、恶霉灵0.15克、琼脂18克、水1000毫升制成菌种培养液；将稀释液与菌种培养液按1: 9的重量比例一起倒入培养皿内制成平板，26°C下培养48小时，经分离获得木霉菌菌株，经纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种。
2.二级菌种的制备:取马铃薯170克、葡萄糖或蔗糖18克、水1000毫升，配制成二级发酵培养液，调PH值为7，分装在250毫升三角瓶中，装液量为150毫升，在121 °C下灭菌30分钟，接入斜面母菌种，摇床转速为170转/分，发酵温度28°C，发酵时间为3天，得到大量发散的絮状菌丝及分散的分生孢子二级菌种。
3.固体发酵:所采用的固体发酵培养基成分为:培养料草炭或秸杆粉或树叶粉28克、稻壳12克、水60克、磷酸二氢钾0.2克、硫酸镁0.15克、硫酸钙0.1克。制作方法是先将无机盐溶入水中，再将培养料与水充分混合后制成固体培养基，装入耐高温塑料袋或发酵瓶中，在120°C下灭菌80分钟，按重量百分比接入8%的二级菌种，控制发酵温度为27°C，发酵时间5天，至培养料变成绿色即木霉菌分生孢子。4.生防菌剂的制备:将满载木霉菌孢子的固体培养料经常温干燥后，用万能粉碎机粉碎成高浓度木霉菌孢子粉，取重量比例为40%孢子粉与重量比例为59.99%轻质碳酸钙，再加入重量比例为0.01%的恶霉灵作为增效剂，充分混合后制成木霉菌制剂。用于甜瓜枯萎病防治结果表明:在甜瓜播种时以木霉菌制剂200倍拌土与恶霉灵4000倍拌土同时施用，装营养钵育苗，4叶期再以木霉菌制剂200倍兑水、与恶霉灵4000倍兑水同时施用灌根一次，并分别以单用木霉菌制剂和恶霉灵做对照，其防治效果分别为88.27%,74.34%和83.41%,复合处理比单独处理增加防效13.93%和4.86%。用于辣椒枯萎病防治结果表明:在辣椒移栽时用木霉菌制剂300倍拌土与恶霉灵5000倍拌土同时施用，采用上铺下垫办法穴施，一个月后再以木霉菌制剂300倍兑水、与恶霉灵5000倍兑水同时施用灌根一次，并分别以单用木霉菌制剂和恶霉灵做对照，其防治效果分别为78.36%,69.76%和76.23%,复合处理比单独处理增加防效8.6%和2.13%。实施例3 1.斜面母菌种的制备:取作物根表土壤10克，加无菌水10千克，制成稀释液；取马铃薯200克、葡萄糖15克、孟加拉红0.07克、硫酸链霉素0.04克、恶霉灵0.2克、琼脂17克、水1000毫升制成菌种培养液；将稀释液与菌种培养液按1: 9的重量比例一起倒入培养皿内制成平板，28°C下培养48小时，经分离获得木霉菌菌株，经纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种。2.二级菌种的制备:取马铃薯200克、葡萄糖或蔗糖15克、水1000毫升，配制成二级发酵培养液，调PH值为8，分装在500毫升三角瓶中，装液量为200毫升，在121 °C下灭菌40分钟，接入斜面母菌种，摇床转速为200转/分，发酵温度30°C，发酵时间为2天，得到大量发散的絮状菌丝及分散的分生孢子二级菌种。
3.固体发酵:所采用的固体发酵培养基成分为:培养料草炭或秸杆粉或树叶粉34克、稻壳11克、水55克、磷酸二氢钾0.15克、硫酸镁0.1克、硫酸钙0.2克。制作方法是先将无机盐溶入水中，再将培养料与水充分混合后制成固体培养基，装入耐高温塑料袋或发酵瓶中，在120°C下灭菌90分钟，按重量百分比接入10%的二级菌种，控制发酵温度为30°C，发酵时间4天，至培养料变成绿色即木霉菌分生孢子。4.生防菌剂的制备:将满载木霉菌孢子的固体培养料经常温干燥后，用万能粉碎机粉碎成高浓度木霉菌孢子粉，取重量比例为49.99%孢子粉与重量比例为50%轻质碳酸钙，再加入重量比例为0.01%恶霉灵作为增效剂，充分混合后制成木霉菌制剂。用于人参锈腐病防治结果表明:在2年苗移栽时先用木霉菌制剂每帘(10平方米)200克均匀混入参床耕作层，展叶后再以木霉菌制剂200倍加恶霉灵5000倍兑水灌根一次，以单用木霉菌制剂做对照，其防治效果分别为87.97%和71.15%，复合处理比单独处理增加防效16.82%，优质人参比率提高27.22%。用于人参根腐病防治结果表明:在2年苗移栽时先用木霉菌制剂每帘(10平方米)250克均匀混入参床，展叶后再以木霉菌制剂400倍加恶霉灵5000倍兑水灌根一次，以单用恶霉灵制剂做对照，其防治效果分别为91.43%和81.89%，复合处理比单独处理增加防效
9.54%ο木霉菌与恶霉灵同时施用具有显著协同增效作用。除了本发明的木霉菌制剂外，还可采用其他多种木霉菌制剂与杀菌剂恶霉灵协同施用。木霉菌制剂中还可采用多种其他固体培养基，只要能够提供木霉菌生长并同时具有改良土壤作用即可。参考文献:
1.生防木霉菌的生物安全性检测.中国农业科学，2006(4)
2.绿色木霉菌T23对黄瓜枯萎病防治效果及防御酶活性影响.植物病理学报，2005 (2)
3.几种常用土壤杀菌剂对木霉菌防治甜瓜枯萎病效果的影响.中国蔬菜，2005(8)
4.五种杀菌剂对木 霉菌及尖孢镰刀菌的毒力测定.植物保护.2005(3)
权利要求
1.一种防治作物土传病害生防菌剂的制备方法，其特征在于包括如下具体步骤: (1)斜面母菌种的制备:取作物根表土壤5-10克，加无菌水1000倍成稀释液； 取马铃薯150-200克、葡萄糖15-20克、孟加拉红0.04-0.07克、硫酸链霉素0.03-0.04克、恶霉灵0.1-0.2克、琼脂17-20克、水1000毫升制成菌种培养液；将稀释液与菌种培养液按1: 9的重量比例一起倒入培养皿内制成平板，25-28°C下培养48小时，经分离获得木霉菌菌株，经纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种； (2)二级菌种的制备:取马铃薯150-200克、葡萄糖或蔗糖15-20克、水1000毫升，配制成二级发酵培养液，调PH值为6-8，分装在250-500毫升三角瓶中，装液量为100-200毫升，在121°C下灭菌30-40分钟，接入斜面母菌种，摇床转速为150-200转/分，发酵温度26-30°C，发酵时间为2-4天，得到大量发散的絮状菌丝及分散的分生孢子二级菌种； (3)固体发酵:所采用的固体发酵培养基成分为:培养料草炭或秸杆粉或树叶粉28-40克、稻壳10-12克、水50-60克、磷酸二氢钾0.1-0.2克、硫酸镁0.1-0.2克、硫酸钙0.1-0.2克；先将无机盐溶入水中，再将培养料与水充分混合后制成固体发酵培养基，固体发酵培养基装入耐高温塑料袋或发酵瓶中，在120°C下灭菌70-90分钟，接入重量比例5-10%的二级菌种，控制发酵温度为25-30°C，发酵时间4-6天，至培养料变成绿色即木霉菌分生孢子； (4)作物土传病害生防菌剂的制备:将满载木霉菌孢子的固体培养料经常温干燥后，用万能粉碎机粉碎成高浓度木霉菌孢子粉，取重量比例为30-49.99%孢子粉与重量比例为50-69.99%轻质碳酸钙或硅藻土，再加入重量比例为0.01%的恶霉灵作为增效剂，充分混合后制成木霉囷制剂。
2.一种如权利要求1所 述的防治作物土传病害生防菌剂的应用，其特征在于将权利要求I制备的木霉菌生防菌剂200-400倍用于防治作物土传病害，并可与杀菌剂恶霉灵4000-5000倍协同施用，其施用方法为床面拌土或浸蘸种苗或生长期灌根。
全文摘要
本发明提供一种用于防治作物土传病害的生防菌剂的制备方法及其应用。采用木霉菌株(Trichodermaviride)为母菌剂，以草炭粉、秸秆粉和树叶粉，硅藻土和轻质碳酸钙为载体制成生防菌制剂，并以微量杀菌剂恶霉灵作为增效剂。用于防治由镰孢菌等病原真菌引起的作物土传病害。本发明的特征在于利用木霉菌对恶霉灵的敏感性差异将木霉菌生防菌剂与恶霉灵协同施用，具有既能抑制土壤中病原菌萌发，又能促进木霉菌的繁殖，同时促进作物根系生长的多重协同功效。
文档编号C12R1/885GK103141519SQ201310066268
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月4日 优先权日2013年3月4日
发明者郑雅楠, 魏汉莲, 杨长成, 高增贵, 李可强, 关昕, 庄敬华 申请人:沈阳农业大学