专利名称：一株枯草芽孢杆菌及其在真菌病害防治中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌，及其在烟草或蔬菜真菌病害防治、促进烟草或蔬菜生长中的应用，属于生物防治领域。
背景技术：
长期以来，植物病害以化学防治为主，但受到高效低毒的杀菌剂农药品种少、防效易受环境条件影响、易造成环境污染和产生抗药性等问题困扰。生物防治具有对环境、生态和人类健康安全的优点，在病虫害综合治理中发挥了越来越大的作用，并被认为是实现农业可持续发展的重要手段。随着人们对环境安全和健康的关注，对烟草(吸食品)和蔬菜产品的质量要求也越来越高，无公害、绿色食品甚至有机食品逐渐成为消费市场的主流，因此，采用生物防治技术得到了广泛的认可。近年来，国内外广泛利用有益微生物及其代谢产物来抑制病原菌生存和活动，使得这一防治措施得以快速发展。美国已有GB03、MBI600、QST713和解淀粉枯草芽孢杆菌变种等4株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可。在德国解淀粉枯草芽孢杆菌变种 raBM被商业化生产，用于控制粮食作物的不同真菌病害。我国已开发成功并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等。上述产品主要用于粮食和果树真菌病害的防治，尚未见用于烟草、辣椒、黄瓜、茄子、番茄真菌病害的报道。国内已报道防治烟草赤星病、黑胫病等真菌病害的拮抗细菌主要有荧光假单胞杆菌(顾金刚等，2004;李洪林等，2008)、绿针假单胞菌(王远山等，2002)、短小芽孢杆菌 AR03 (王静，2010)、枯草芽孢杆菌(易龙等，2007 ；张成省等2008)，防治辣椒疫病拮抗细菌解淀粉芽孢杆菌(柳凤，2009)，防治黄瓜枯萎病、茄子黄萎病、番茄叶霉病等蔬菜真菌病害拮抗细菌未见报道。上述研究仅是生防菌株筛选与机理研究，并未将其制成适用于工业化生产和应用的制剂，其实际应用存在难题。本发明人已经努力开发了一种具有强抗真菌活性、促进植物生长、防治真菌病害、 改善烟叶品质的多功能新微生物杀菌剂，所述植物病害包括烟草赤星病、烟草黑胫病、辣椒疫病、番茄叶霉病、茄子黄萎病和黄瓜枯萎病。经检索，在所有已申请的专利文献中均没有涉及本发明主题的文献报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌，其对烟草或蔬菜真菌病害具有防治作用，对烟草或蔬菜的生长具有促进作用，对烟叶品质的提高也有一定的作用。 本发明还提供了一种由该菌种培养制备而成的微生物制剂。本发明是通过以下技术方案实现的一株枯草芽孢杆菌，该菌株命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtil is，已于2008 年12月四日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为 CGMCCNo. 2843。
本发明所涉及的枯草芽孢杆菌Tpl355，其分离鉴定、培养方法、生物特性、发酵条件等，已经公开，记载在中国文献“烟草叶围细菌Tpb55菌株的鉴定及其抑菌活性，中国生物防治，2008，24 (1) :63-68"以及“烟草赤星病拮抗细菌Tpb55摇瓶发酵条件的筛选，中国烟草科学2009，30(1)54_57”上，在此不再赘述。一种微生物制剂，由枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Tpb55的全培养液培养物和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Tpb55的孢子组成；该制剂对烟草或蔬菜真菌病害具有防病促生作用。其可通过以下制备方法制备得到(1)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Tpb55试管种接种于肉汤培养基(为常规培养基，其配方为公知，在此不再赘述)摇瓶中，振荡培养至对数期；(2)将上述培养好的菌种按种子罐培养基的体积比10%接种量接入30L种子罐， 培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为葡萄糖10g/L、蛋白胨3g/L、MgSO4 0. 5g/ L、酵母膏1. 5g/L，牛肉膏1. 5g/L ；培养条件溶氧量为15-18%，搅拌速度200rpm，发酵温度 31°C ；(3)将种子液生产罐培养基的10%的接种量接入生产罐培养，生产罐培养基配方为玉米粉 20g/L、豆饼粉 50g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，MnSO4 · H2O 10g/L ；培养条件溶氧量为15-18%，搅拌速度200rpm，发酵温度31°C ；培养至最终生物量为109cfu/g，芽孢形成率达97%以上，发酵完成；(4)发酵完成后，培养液出罐，用白炭黑吸附用包装袋装成固体剂型。本发明的菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是从烟草叶面生境中分离筛选到的，经实验证明，本发明的枯草芽孢杆菌的发酵液对烟草赤星病、辣椒炭疽病等真菌病害病原菌有很强的抑制作用，对烟草赤星病、烟草黑胫病、辣椒炭疽病、番茄枯萎病、黄瓜疫病、茄子黄萎病、大葱紫斑病、芦笋茎枯病等显示出很好的防病效果，同时对烟草、辣椒、黄瓜、番茄和茄子具有良好的促生作用，因此，本发明的枯草芽孢杆菌可以用于制备生物防治烟草或蔬菜真菌病害的菌剂，也可以用于制备促进烟草或蔬菜生长的生长剂。另外，实验还表明，本发明的菌株对烟叶品质的提高也有作用。可以预见，本发明的菌株在烟草或蔬菜真菌病害的生物防治领域将有广阔的应用前景。上述描述中，所述烟草赤星病是由链格孢菌烟草专化型(Altternaria altternata f. sp. nicotianae)引起的。所述烟草黑胫病是由寄生疫霉烟草变种 (Phytophthora parasitica var. nicotianae)引起的。所述辣椒疫病是由辣椒疫霉 (Phytophthora capsici)引起的。所述辣椒炭疽病是由辣椒刺盘孢(Colletotrichum capsici)引起的。所述番茄枯萎病是由番茄尖镰孢菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)引起的。所述黄瓜枯萎病是由尖镰孢菌黄瓜专化型病菌(Fusarium oxysporum f. . sp. cucumerinum)弓丨起的。所述黄瓜疫病是由瓜疫霉(Phytophthora melonis)引起的。所述茄子黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的。所述大葱紫斑病是由香葱链格孢(Alternaria porri)引起的。所述芦笋茎枯病是由天门冬拟蓬点霉(Phomopsis asparagi)弓丨起的。
本发明的枯草芽孢杆菌Tpb55命名为Bacillus subtilis，已于2008年12月四日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO. 2843， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编100101。图1 本发明的枯草芽孢杆菌Tpb55 (Bacillus subtilis Tpb55)菌株对辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)菌丝的生长平板抑制作用示意图。图2 本发明的枯草芽孢杆菌Tpb55 (Bacillus subtilis Tpb55)菌株抑制烟草赤星病菌(Alternaria alternate)示意图，图中可见，烟草赤星病菌发生畸形，菌丝膨大呈结节状。图3 本发明的枯草芽孢杆菌Tpb55 (Bacillus subtilis Tpb55)菌株处理烟草赤星病菌(Alternaria alternate)示意图，图中可见，菌丝末端膨大，破裂，原生质泄漏。图4 本发明的枯草芽孢杆菌Tpb55 (Bacillus subtilis Tpb55)菌株发酵液处理烟草赤星病菌(Alternaria alternate)示意图，图中可见，赤星病菌分生孢子不萌发，且产
生囊泡。 图5 本发明的枯草芽孢杆菌Tpb55 (Bacillus subtilis Tpb55)菌株发酵液处理烟草赤星病菌(Alternaria alternate)示意图，图中可见，分生孢子囊泡破裂，分生孢子彻底消解。图6 烟草赤星病菌(Alternaria alternate)分生孢子正常萌发、菌丝正常生长示意图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1菌株对烟草和蔬菜真菌病害病原菌生长的抑制作用采用滤纸片法测定菌株Tpb55对烟草和蔬菜真菌病害病菌的拮抗作用取发酵液 20 μ 1于灭菌滤纸片上，晾干后移至燕麦培养基平板中央，在滤纸片四周等距离接入病原菌菌饼(ΦρΟ. 5cm)，于28°C培养3 4d，测定抑菌圈大小。每种靶标菌重复3次，结果取平均值。燕麦琼脂培养基燕麦片30g，琼脂20g，水lOOOmL。燕麦片加水IOOOmL,在沸水浴上加热lh，纱布过滤后加水补足IOOOmL,加琼胶熔化后分装灭菌(12rC，20min)。结果如表1所示，可见，菌株Tpb55对烟草赤星病菌、烟草黑胫病、辣椒疫病菌、辣椒炭疽病菌、番茄枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜疫霉菌、茄子黄萎病菌、大葱紫斑病菌、芦笋茎枯病菌等病原真菌具有明显的抑制作用。图1所示为Tpb55菌株对辣椒炭疽病菌菌丝生长抑制作用。挑取抑菌圈边缘菌丝显微镜下观察，发现Tpb55菌株可以导致病原菌菌丝畸形、甚至消解。如图2所示，Tpb55菌株导致烟草赤星病菌膨大呈结节状，顶端形成泡囊， 泡囊破裂后发生原生质泄漏(图3)。 表1菌株Tpb55对植物病原真菌抑制作用
权利要求
1.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于该菌株命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2009年1月15日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏， 保藏编号为CGMCC No. 2843。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在烟草真菌病害防治中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述烟草真菌病害包括烟草赤星病，黑胫病。
4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在蔬菜真菌病害防治中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述蔬菜真菌病害包括辣椒疫病，辣椒炭疽病，番茄叶霉病，黄瓜枯萎病，茄子黄萎病、大葱紫斑病、芦笋茎枯病。
6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在促进烟草或蔬菜生长中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述蔬菜包括黄瓜，辣椒，茄子，番茄。
8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在改善烟叶品质中的应用。
9.一种微生物制剂，其特征在于由枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Tpb55的全培养液培养物和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Tpb55的孢子组成。
10.根据权利要求9所述的微生物制剂，其特征在于其是通过以下制备方法制备得到的(1)将枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis Tpb55试管种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；(2)将上述培养好的菌种按种子罐培养基的体积比10%接种量接入30L种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为葡萄糖10g/L、蛋白胨3g/L、MgSO4 0. 5g/L、 酵母膏1. 5g/L，牛肉膏1. 5g/L ；培养条件溶氧量为15-18%，搅拌速度200rpm，发酵温度 31 °C ；(3)将种子液生产罐培养基的10%的接种量接入生产罐培养，生产罐培养基配方为 玉米粉 20g/L、豆饼粉 50g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，MnSO4 · H2O 10g/L ；培养条件溶氧量为 15-18%，搅拌速度200rpm，发酵温度31°C ；培养至最终生物量为109cfu/g，芽孢形成率达 97%以上，发酵完成；(4)发酵完成后，培养液出罐，用白炭黑吸附用包装袋装成固体剂型。
全文摘要
本发明公开了一株枯草芽孢杆菌，该菌株命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2009年1月15日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.2843。本发明的菌株枯草芽孢杆菌是从烟草叶面生境中分离筛选到的，经实验证明，其发酵液对烟草赤星病、辣椒炭疽病等真菌病害病原菌有很强的抑制作用，对烟草赤星病、烟草黑胫病、辣椒炭疽病、番茄枯萎病、黄瓜疫病、茄子黄萎病等显示出很好的防病效果，同时对烟草、辣椒、黄瓜、番茄和茄子具有良好的促生作用，因此，本发明的枯草芽孢杆菌可以用于制备生物防治烟草或蔬菜真菌病害的菌剂，也可以用于制备促进烟草或蔬菜生长的生长剂。
文档编号A24B15/20GK102154186SQ20111009341
公开日2011年8月17日 申请日期2011年4月14日 优先权日2011年4月14日
发明者关小红, 孔凡玉, 张成省 申请人:中国农业科学院烟草研究所