专利名称：一种快速筛选抗植物病害真菌海洋微生物的方法
技术领域：
本发明涉及抗植物病害真菌海洋微生物的筛选，具体的说是一种快速筛选抗植物病害真菌海洋微生物的方法。
背景技术：
在农业生产中，一些真菌对作物产生病害作用，使农业生产受到很大危害；像紫青霉菌产生毒素对大豆生长产生毒害作用，使大豆减产，造成很大损失。现有技术中，针对有害真菌，人们不断在自然界中寻找能够杀灭或拮抗有害真菌的微生物和其产生的活性物质，有害真菌往往是被作为靶子菌来参加筛选及检测的过程，但绝大多数有害真菌因生长缓慢(48-72hr)、易扩散(产生飞散的孢子等)的特性，在实际检测中费时费力，效率低，有时还影响检测结果的时效并造成实验室污染，而令人头痛，其方法的局限性与先进性不足之处显而易见。
发明内容
为了克服传统技术中的不足，本发明的目的是提供一种操作简单、结果可靠、效率高的快速筛选抗植物病害真菌海洋微生物的方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为1)以皱褶假丝酵母菌株和植物病害真菌用抗真菌抗生素作标准单位，进行平行抑菌试验，选出可作为指示菌的皱褶假丝酵母菌株；2)以步骤1)得到的皱褶假丝酵母菌株作指示菌，筛选对其有抑制作用的海洋微生物。
筛选过程中的抑菌时间通常为10～24小时；抑菌筛选过程中皱褶假丝酵母菌于培养基中的菌体浓度最好应≥106个/毫升；抑菌筛选一般在26～32℃下进行；抗真菌抗生素可为制霉菌素、酮康唑或两性霉素等；筛选过程中一般采用平板抑菌实验进行操作；平板抑菌实验常用的有挖块法、杯碟法、打孔法或滤纸片法。
本发明具有如下优点1.效率高。本发明以同是真菌但生长速度快的类似细菌的皱褶假丝酵母代替植物病原菌测定抗菌活性，结果快速(10-24hr)。
2.操作简单。本发明所用的皱褶假丝酵母无害、无毒、无孢子飞散，菌落形态酷似细菌，在微生物生物测定抗真菌活性的方法中，代替生长缓慢、易扩散，检测抑菌边缘不清晰，易于污染的病原真菌作为靶子菌，无污染，抑菌边缘清晰，方法简单易行。
3.结果可靠。本发明所用的指示菌是从多种无害酵母菌中筛选出来的，对其有抑菌活性的海洋微生物对植物病害真菌也有抑制作用，准确稳定。
总之，本发明原则上可应用到各种来源的微生物及其它抗真菌物质的抗菌活性测定，采用双层培养基培养检测或平皿涂菌培养检测的方法，可以方便快速测定海洋微生物(主要是海洋放线菌)及其它来源的微生物的抗菌活性，促进了从微生物中筛选抗真菌资源的工作效率，并简化了已有相关测定技术。
具体实施例方式
实施例11.快速筛选指示菌的选取选取无害、生长速度快皱褶假丝酵母菌28株和三株植物病害真菌紫青霉菌(Penicillum purpurogenum)、镰刀菌(Fusarium solani)及葡萄孢菌(Botrytis fuckeliana)，用制霉菌素(也可为其它的抗真菌药物)进行平行抑菌试验，确定植物病害真菌和无害酵母对抗生物质的反应及敏感的相关性；其中有3株皱褶假丝酵母菌株和紫青霉菌对制霉菌素具有相同的反应(对皱褶假丝酵母菌株和植物病害真菌用抗真菌抗生素进行平行抑菌试验，它们会同时出现抑菌圈)，从而选出它们皱褶假丝酵母菌株作为快速筛选指示菌；1)指示菌的制备(检测菌培养)取一环酵母菌的培养琼脂斜面种子接种于装有10ml液体培养基的试管中，28℃培养24小时备用；选用常规的酵母菌培养基即可，液体培养基组成为葡萄糖2％、酵母膏1％、蛋白胨0.2～0.3％，调PH6.5-7.0，115℃灭菌20分钟；固体培养基既在液体培养基中加入2％琼脂；2)双层平板的制备将新培养的指示菌制成菌悬液用移液管取28℃培养24小时的菌液0.3ml，加入装有50ml温度在50～55℃之间的液体培养基的三角瓶中，摇匀后取5ml加入含有约15ml凝固培养基作下层的平皿中，即得双层平板。
2.抗植物病害海洋微生物的快速筛选采用挖块法看分纯的海洋链霉菌和海洋细菌对选出的皱褶假丝酵母菌株产生的抑菌效果，从而快速筛选出对植物病害有抑制作用的海洋微生物；具体为在制成双层平板上放入长有试验菌的琼脂块，培养10～24小时，即可获得其抗菌活性结果。
1)试验菌的制备从中国沿海采样分离得到海洋链霉菌941株，将分纯的海洋链霉菌涂于其适于生长的固体平板上，28℃培养7天后备用；2)检测双层培养液化固体培养基倒底层平板，冷凝后再将在54℃水浴中保温的混有酵母菌的固体培养基(每50ml培养基加0.3ml液体培养物)，倒上层平板，凝固后，平皿中放入待检测的海洋链霉菌样品琼脂块，28℃静置培养10-24hr，获得有抗菌活性的海洋链霉菌38株。
实施例2与实施例1不同之处在于，抗植物病害海洋微生物的快速筛选，1)试验菌的制备从中国沿海采样分离得到海洋芽孢菌71株，将分纯的海洋芽孢菌涂于其适于生长的固体平板上，28℃培养1天后备用；检测双层培养液化Y76固体培养基200ml倒底层(木框或不锈钢框)，冷凝后再将在54℃水浴中保温的混有Y76酵母菌的固体Y76培养基(每50ml培养基加0.3ml液体培养物)，倒上层，待凝后，放入待检测样品海洋芽孢菌琼脂块，28℃静置培养10-24hr，获得有抗菌活性的海洋芽孢菌9株。
实施例3筛选出菌株的检测以假丝酵母为靶子菌筛选得到有拮抗作用的海洋细菌和海洋链霉菌47株，平行测定对紫青霉菌和假丝酵母的抑菌活性，确定靶子菌与紫青霉菌对筛选到菌株的反应及敏感相关性，测定结果显示筛选出的菌株对紫青霉菌同样有抑制作用；用筛选出的菌株对植物致病菌镰刀菌及葡萄孢菌进行抑菌试验，结果同样有效。
其中有一株皱褶假丝酵母菌株Y76的应用效果极好。
权利要求
1.一种快速筛选抗植物病害真菌海洋微生物的方法，其特征在于1)以皱褶假丝酵母菌株和植物病害真菌用抗真菌抗生素进行平行抑菌试验，选出可作为指示菌的皱褶假丝酵母菌株；2)以步骤1)得到的皱褶假丝酵母菌株作指示菌，筛选对其有抑制作用的海洋微生物。
2.按照权利要求1所述的快速筛选抗植物病害真菌海洋微生物的方法，其特征在于筛选过程中的抑菌时间为10～24小时。
3.按照权利要求1所述的快速筛选抗植物病害真菌海洋微生物的方法，其特征在于抑菌筛选过程中皱褶假丝酵母菌于培养基中的菌体浓度应≥106个/毫升。
4.按照权利要求1所述的快速筛选抗植物病害真菌海洋微生物的方法，其特征在于抑菌筛选在26～32℃下进行。
5.按照权利要求1所述的快速筛选抗植物病害真菌海洋微生物的方法，其特征在于所述抗真菌抗生素为制霉菌素、酮康唑或两性霉素。
6.按照权利要求1所述的快速筛选抗植物病害真菌海洋微生物的方法，其特征在于筛选过程中采用平板抑菌实验进行操作。
7.按照权利要求6所述的快速筛选抗植物病害真菌海洋微生物的方法，其特征在于所述平板抑菌实验为挖块法、杯碟法、打孔法或滤纸片法。
全文摘要
本发明涉及抗植物病害真菌海洋微生物的筛选，具体的说是一种快速筛选抗植物病害真菌海洋微生物的方法，1)以皱褶假丝酵母菌株和植物病害真菌用抗真菌抗生素进行平行抑菌试验，选出可作为指示菌的皱褶假丝酵母菌株；2)以步骤1)得到的皱褶假丝酵母菌株作指示菌，筛选对其有抑制作用的海洋微生物。本发明具有如下优点效率高，操作简单，结果可靠，促进了从微生物中筛选抗真菌资源的工作效率，并简化了已有相关测定技术。
文档编号C12Q1/18GK1566359SQ03133879
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月9日 优先权日2003年7月9日
发明者马成新, 胡江春, 薛德林, 刘全永, 王书锦 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所