专利名称：防治烟草土传真菌病害的木霉固体颗粒剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物农药，更具体地说，本发明涉及一种防治烟草土传真 菌病害的生物制剂及其制备方法。
背景技术：
烟草土传病害(soil borne tobacco diseases)是烟草病害中危害较为严重的 一大类病害，这类病害病原能在植烟土壤中存活、繁殖，并侵染根、根胫部， 或通过根、根胫部侵染，引起根、根胫部病变，或全株性病变，其发生特点 是积年流行、逐年加重。这些土传病害中真菌性土传病害发生较多，危害较 重，有些成为烟草农业生产中重要的经济病害。这类真菌性病害有烟草黑胫 病(尸/zj^op/^/zora/ aros7Y/ca var. "/co"'a"ae)、 猝〈到病(尸;^/z/m附spp.)、 立才古病 (朋/zoctomV^o/flm〕等。其中，苗期为害较重的土传病害是猝倒病，其病原主 要为瓜果腐霉(i^/z/wm a/ /za"/(i^wa^w )等腐霉属真菌；大田期较为重要 的病害有烟草黑胫病。这两种病害的病原已高度适应了烟株根部环境，致使
烟株整个大田期均可感病。 一般感病越早，病害损失越大。现有技术采用抗 病品种及轮作为主的综防措施控制'，但效果并不理想。
烟草主要土传真菌病害的生物防治已引起国内外的高度重视。当前进展 最快的是以木霉(7Hcto^mzaspp.)研制的生防制剂用于烟草黑胫病、立枯 病、猝倒病的生物防治。
木霉菌是一类理想的生防菌，在植物病害生物防治上占有非常重要的地 位。目前在国内外注册的商品生防制剂已达十几种。近十几年来，木霉生防 制剂的生产工艺日臻完善，菌剂专利技术明显上升。釆用液体深层发酵得到 的芽生孢子寿命短且生活力弱；固体培养可得到贮存期相对较长的分生孢 子，但生产周期长、菌剂含孢量低。最近几年，液固两相法制备木霉菌高孢 粉技术的成熟大大增强了木霉菌的实用性进程。但液固两相法菌剂生产中， 固体培养的质量不容易控制，阻碍了木霉菌剂的规模化生产。因此，木霉制 剂的工业化、标准化、商品化生产问题还有待进一步探索。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种有效、无毒、 安全、无残留、使用简便的防治烟草土传真菌病害的木霉固体颗粒剂。同 时，本发明还提供该木霉固体颗粒剂的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
*除非另有说明，本发明中所釆用的百分数均为质量百分数。 本发明提供了一种防治烟草土传真菌病害的木霉固体颗粒剂。
本发明的生防菌株其分类命名为哈茨木霉(7Hc/zocfem^ /wra'a"wm) TR13,保藏编号为CGMCCNo.2849。
本发明的生产菌株哈茨木霉(7Hc/7o&rwa /wCa"Mw) TR13 ，分离自 云南昆明根际土壤，经培养性状、形态学测定，该生防真菌为哈茨木霉 (7h'c/zod^wa/za/^am^)的一个新菌株TR13。该菌株具有以下特征①菌 落在PDA平板上生长速度在1.5mm/h以上，成同心圆生长，绒毛状，初生 菌丝白色，老熟时暗绿色。②光学显微观察，孢子梗常常2 3个一组，环 状排列，直角伸出，呈树状。孢子梗短，基部变细，中间膨大，长3.0~4.3pm ， 中间宽6.5~8.0|am ，基部宽2.0 3.2pm。瓶梗2.0-2.8 jumx3.5~5.5pm,分生 孢子球形，短倒卵形，基部平截，孢子大小2.5 3.5 pmx2.5 3.0 pm。③抑 菌能力强，可产生(3-l，3葡聚糖酶、纤维素酶，对黑胫病(户/^c^/^ora ; ara57'ft'ca var. m'cof/a"ae )、立枯病(A/ /zoctow'a so/am')、猝倒病(尸jKf/^"m spp.，其中以/y/n^m op/ww'^fermWww为主)等烟草土传真菌病原有显著的 抑制作用，主要表现为重寄生。④定殖能力强，可在烟草的根际、根内定 殖，促进烟草幼苗生长。
本发明通过哈茨木霉(7Hc/2ocfer附a /2jz/a"wm) TR13菌株的菌种复壮， 菌种制备，液体发酵培养，固体发酵培养，制备木霉固体颗粒剂，将其运 用于烟草上，测定其对烟草土传真菌病的防治效果。
本发明提供了一种木霉固体颗粒剂的制备方法，该方法釆用以下步骤
l.菌种复壮
由于木霉菌株是一种兼性寄生的生防菌株，人工培养的过程往往是营养 类似腐生的一种生活方式，而且生产菌株传代代数一般较多，使木霉菌株的 寄生能力下降，制剂对病害的防治能力减弱。为保持制剂的防效稳定性，必须对生产的菌种进行复壮。 具体操作如下
1) 菌种的活化
挑取TR13菌种上少量的孢子粉，点接于新制备、表面无明显冷凝水的
PDA平板上，27.5土rC光照培养2 3天。待长出菌落后，切取生长较快的 菌丝块(尽可能将多余的培养基块削去)，再转接于PDA平板，27.5 土rC光 照培养2 3天，剔除污染的平板，选择菌丝生长较快的平板继续培养，每曰 定时观察菌丝的生长与产孢状况，选择生长速度快、产孢量大的平板培养物 作为复壮的出发菌株。
2) 平板对峙培养
挑取新鲜的复壮出发菌株孢子粉点接于PDA平板的一侧，距离3 4cm 的另 一侧接种(J)4mm新鲜的立枯丝核菌(i /2/zoctom'a w/am')( —种生长速 度较快的土传真菌病害病原)菌丝块。接种后的平板27.5土rC光照培养5 7 天，直至复壮的出发菌株的菌丝越过立枯丝核菌菌丝，并在其上产孢为止。 3)菌种的分离、纯化
挑取对峙培养中的复壮出发菌株在立枯丝核菌菌落上产生的孢子于 PDA平板上划线分离、纯化，选择生长快的单菌落转接于PDA平板进行纯 培养，再在这些纯培养物中挑选产孢快、产孢量大的培养物，转接PDA斜 面，产孢后的菌种即为复壮的菌种。 2.菌种的制备
菌种的好坏直接影响到发酵的各个工序，有质和量的要求。质的要求包 括①菌种无杂菌污染。显微观察为菌体形态正常，形体较一致；②菌种 应处于相同的生理状态，以期菌种能充分地生长和繁殖，进行同步生长。供 生产用的斜面菌种在冰箱内保存最多不超过7天。量的要求包括①菌种 的含菌量。菌种的种子液含孢子量不低于106个/1111。②菌种的接种量。需 通过试验来确定，要考虑尽量缩短发酵周期、控制繁殖代数。将种子液的体 积与发酵液的体积之比控制在一定的范围内。
菌种的制备首先从保存的菌种(如密封斜面试管)转接PDA平板进行 活化2次，再转接摇瓶，然后以一定的比例接种种子罐，最后移种至发酵生 产罐。具体步骤如下(1) 平板菌种的培养
按无菌操作从活化的平板菌种中，挑取2 4mmx2 4mm的菌丝块，3~5 点点接于PDA平板上，置27.5土rC、光照培养5 7天。在接种后培养的过 程中注意每天定时检查平板，如有污染或生长异常的培养物应及时淘除。平 板菌种的质量标准为无杂菌污染，产孢快、产孢量大，颜色深绿，孢子大 小较一致，轮廓清晰，混有少量菌丝。 .
(2) 液体菌种的制备
按无菌操作从制备的平板菌种中，挑取6 8块2 4mmx 2~4mm的菌 丝块，加到装有灭菌PD液的三角瓶(装液量容积比为30%~50%)中，27.5 土1。C、光照、150r/m培养2天。液体菌种的标准为无杂菌，菌体处于旺 盛生长期，菌丝体浓稠。
3. 液体发酵培养
将液体菌种以2%~5%的体积比接入盛有液体发酵培养基SDIS (配 方为大豆蛋白胨10g、蔗糖10g、酵母粉2g、磷酸二氢钾lg、硫酸 镁0.3g、自来水1000ml、花生油0.1%、消泡剂0.01%、 pH自然。) 的发酵罐中，28土rC，以培养基:空气为1:1.6-2.2的体积比通气，转速 120转/分钟搅拌，培养36 42小时。以液体菌丝乳白色、粘稠，菌丝体 干重5mg/mL以上为合格发酵液。
4. 固体发酵培养
(1) 接种
将合格的发酵液按20%~30%的质量比接种于固体发酵培养基RS[配方 为稻壳卯％, 1 3mm的粗麦麸10%,用矿质无机盐(硫酸氨2g,磷酸二 氢钾0.5g， 磷酸二氢钠0.5，硫酸镁lg，氯化钩0.5g, 1000ml自来水) 溶液湿润，使其含水量为25%~30%。]中。接种时，边加发酵液边搅拌，至 固体物料含水量50%~60%。
(2) 装盘
用底部装有l-2mm的筛网、深4 6cm的不锈钢浅盘盛装，再将浅盘置 于培养架上。
(3) 培养
黑暗培养浅盘中的物料在28士rC、相对湿度90%~95%的黑暗条件下培养2 3天，检查物料，发现物料内外布满白色菌丝为合格。
光照培养在每层培养架的顶部加光，24小时光照，在温度为35土rC、 相对湿度50% 60%、对流通风的条件下培养2 3天，每12小时翻盘1次， 检查颗粒状物料布满绿色分生孢子，血球计数板计数每克干物料分生孢子含 量在109个以上的为合格。
5.制剂化
合格固体培养物45± rC干燥12-24小时，加质量比10%~15%的硅藻 土 (保护剂)、质量比0.1°/。~0.2%的敌克松原粉(增效剂)，混匀，粉碎 成粒径为0.1 0.2mm的颗粒，装袋。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点
1. 釆用改良的液固两相一步法进行生产 ' 生产菌株在液体发酵中生长菌丝，在固体载体中产孢，实现液固两相一
步法生产，克服以往固体培养时间长、容易污染的缺点，液固培养时间缩短 3~5天。
培养过程分为2个阶段第一阶段为液体发酵阶段，主要生产适合固体 培养的菌浆；第二阶段为固体培养阶段，主要是使菌浆附着在载体的表面， 并在合适的条件下产孢，菌丝生长的营养主要来自液体培养残存的营养成 分。
2. 生产流程可操作性强、重现率高、成功率高
菌种培养时，接种量大，能使生产的菌种迅速占领基质，形成绝对优势 的微生物群体。液体培养时，由于本法采用的接种体为处于同一生理水平的 旺盛生长期菌丝体，种子罐可实现同步生长，其生长基本上呈现出旺盛生长。 固体培养时，菌丝不利用固体物料中的营养，可阻断污染。
对设计出的液固两相一步法生产流程，进行了多次试验，证明了液固两 相一步法生产流程可操作性强、重现率高、成功率高(可达100%),在加强 在线检测的前提下可完全杜绝污染，因此，此流程对于木霉菌固体颗粒剂的 工厂化生产来说是切实可行的。
3. 液体培养采用富营养化培养基
生产菌株在该培养基(SDIS培养基)生长较快，不会形成对菌丝不利 的高渗液体，且菌丝处于旺盛生长期时培养液还含有残余的营养，可满足固体载体上菌丝生长、产孢的营养需求。
4. 固体培养基通透性强
固体培养基的主要原料为谷壳，能大大增强固体培养基的通透性，利于 灭菌，也有利于培养好气的木霉菌丝，还有利于翻盘、光照产孢。
5. 固体培养分菌丝生长、强制产孢2个阶段
黑暗培养适温、高湿、黑暗，有利于菌丝在固体基质中附着、生长；光 照培养高温、低湿、通风、透光，为木霉菌丝产孢创造了良好的条件。
保藏生物材料的说明 本发明的生防菌株其分类命名为哈茨木霉 (7Wc/206few^ /wn/a"^w)
TR13,保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址
北京巿朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏曰期2009年01月
06日；保藏登记入册的编号CGMCCNo.2849。
图1是本发明菌种生产的流程示意图2是本发明实验室小试的工艺流程示意图3是本发明车间中试的工艺流程示意图。
具体实施例方式
通过下面给出的具体实施例和应用实施例，可以进一步清楚地了解本发 明。但它们不是对本发明保护范围的限定。 实施例1 一一实验室小试
工艺流程图中从斜面菌种至摇瓶菌浆为实验室液体菌浆制备阶段，菌浆 接入固体后为作坊式生产过程。具体如下 l.平板菌种的培养
按无菌操作从活化的平板菌种中，挑取已经大量产孢的菌丝，3~5点点 接于平板上，置27.5士rC、光照培养5 7天。在接种后培养的过程中注意每 天定时检查平板，如有污染或生长异常的培养物应及时淘除。为避免由于光
10照不均而导致产孢不一致的培养物出现，可减少堆放层数，如2~3层培养皿， 如条件容许可摆放一层。
2. 液体菌种的制备
将烧红的接种刀冷却，按无菌操作从制备的平板菌种中，挑取6 8块 2~4mm x 2~4mm的菌丝块，加到装有300ml灭菌PD液的500ml三角瓶中， 27.5土rC光照、150r/m培养2天。'通常情况下，摇瓶用菌种尽可能按时分批制备。
3. 液体发酵培养
将液体菌种以2% 5%的体积比接入盛有液体发酵培养基SDIS (配 方为大豆蛋白胨10g、蔗糖10g、酵母粉2g、磷酸二氢钾lg、硫酸 镁0.3g、自来水1000ml、花生油0.1%、消泡剂0.01%、 pH自然。) 的三角瓶中，28土1。C， 150转/分钟振荡培养36 42小时。
4. 固体发酵培养 4.1接种
将合格的发酵液按20%~30%的质量比接种于固体发酵培养基RS[配方 为稻壳90%， l~3mm的粗麦麸10%,用矿质无机盐(硫酸氨2g,磷酸二 氢钾0.5g, 磷酸二氢钠0.5，硫酸镁lg，氯化钩0.5g， 1000ml自来水) 溶液湿润，使其含水量为25%~30%。]中。接种时，边加发酵液边人工搅拌， 至手抓物料用力捏，指头缝刚出水滴出为止(含水量50%~60%)。
4.2装盘
用底部装有l 2mm的筛网、深4 6cm的不锈钢浅盘盛装，再将浅盘置 于培养架上。 4.3培养
黑暗培养浅盘中的物料在28土rC、相对湿度90% 95%的黑暗条件下 培养2 3天。为保持湿度、避免交叉污染，可用消毒的塑料密封培养架。
光照培养在每层培养架的顶部加光，加挂40W日光灯管，24小时光 照，在温度为35士rC、相对湿度50%~60% (调节通风口大小实现)、对流 通风的条件下培养2 3天，每12小时翻盘1次。
5. 制剂化
合格固体培养物45士rC恒温烘箱干燥12~24小时，加质量比10%~15%的硅藻土 (保护剂)、质量比0.1%~0.2%的敌克松原粉(增效剂)，混匀，
粉碎成粒径为0.1 0.2mm的颗粒，质检，装袋。即得本发明的固体颗粒剂。 实施例2 --车间中试
车间中试工艺是在实验室小试基础上改进而成的，其工艺步骤如下 ①平板菌种的培养、②液体菌种的制备同实施例1。
③ 液体发酵培养
将液体菌种以2%~5%的体积比接入盛有液体发酵培养基SDIS的发 酵罐中，28土rC，以培养基:空气为1:1.6~2.2的体积比通气，转速120 转/分钟搅拌，培养36 42小时。
④ 固体发酵培养
接种将合格的发酵液按20y。 30。/。的质量比接种于固体发酵培养基RS 中。接种时，用经过蒸汽灭菌的搅拌机，边加发酵液边搅拌，至手抓物料用 力捏，指头缝刚出水滴出为止(含水量50% 60%)。
装盘用底部装有1 2mm的筛网、深4~6cm的不锈钢浅盘盛装，再将 浅盘置于培养架上。
黑暗培养浅盘中的物料在28士rC、相对湿度90% 95%的黑暗条件下 培养2 3天。为保持湿度，可使用加湿器。
光照培养在每层培养架的顶部加光，加挂40W日光灯管，24小时光 照，在温度为35士rC、相对湿度50% 60%(加湿器、除湿机、强制通风等 共同实现)、对流通风的条件下培养2 3天，每12小时翻盘1次。
制剂化
合格固体培养物45士rC振动流化床干燥4 6小时，加质量比10°/。~15% 的硅藻土 (保护剂)、质量比0.1%~0.2%的敌克松原粉(增效剂)，混句， 粉碎成粒径为0.b0.2mm的颗粒，质检，装袋。即得本发明的固体颗粒剂。
应用实施例l
一一苗期防治烟草猝倒病的效果试验 1.材料与方法 1.1材料
试验药剂本发明固体颗粒剂、50%多菌灵。试验烟草品种K326
试验地点云南省烟草科学研究所大棚温室漂浮育苗池。 1.2试验方法
种子包衣分别按种子包衣剂1%的比例加入本发明固体颗粒剂、50% 多菌灵，对烟草品种K326的裸种进行包衣，以不加防治猝倒病药剂的包衣 种子作空白对照，共形成3种类型的包衣种子。
带病育苗基质的制备瓜果腐霉(烟草猝倒病的主要病原)用l~3mm 的麦麸固体培养基28士1。C培养10 15天，倒出，捣碎，自然晾干，以2% 的质量比与消毒的育苗基质混匀，即可制备得到带猝倒病菌的育苗基质。
试验处理将制备得到带猝倒病菌的育苗基质装入漂浮育苗盘，再分别 播种3种类型的包衣种子，播种的每种类型包衣种子形成l个试验处理，共 3个处理。每处理播种1盘(约280粒包衣种子)，3次重复，盘在同一育苗 池随机排列。
病情调查播种完毕，按正常漂浮育苗措施育苗，至大十字期调查，主 要调查发病率，计算相对防治效果。 2.结果与分析
苗期防治烟草猝倒病试验效果见表1，从表1可看出本发明菌剂对烟草 猝倒病的防治效果达75.36%,略次于50%多菌灵78.58%的防治效果，但相 差不明显。因此，本发明固体颗粒剂可以作为烟草猝倒病的防治药剂使用。
应用实施例2
一一大田期防治烟草黑胫病的效果试验 1.材料与方法 1.1材料
试验药剂本发明固体颗粒剂、48%甲霜灵锰锌。 试验烟草品种红花大金元
表l.苗期防治烟草猝倒病试验效果
调査株数发病株数发病率(％) 相对防治效果(％)
本发明固体颗粒剂 50%多菌灵 空白对照试验地点云南省烟草科学研究所研和试验基地。
1.2试验方法
有机药肥的制备本发明固体颗粒剂与腐熟的有机肥(不含人工制造的 化学肥料)以质量1:10的比例混匀，48%甲霜灵锰锌与同样腐熟的有机肥以 lg/kg的比例混匀，分别形成2种有机药肥。
黑胫病菌谷的制备按烟草品种抗病性鉴定YC/T41-1996行业标准中 所述的方法制备黑胫病菌谷。
试验处理将制备得到的2种有机药肥，在烟苗移栽浇定根水时，按40g/ 株施于移栽烟苗的四周，松土培墒。以同样腐熟的有机肥作空白对照，共形 成3个处理，每处理植烟50 80株。株行距设置、施肥、管理与当地烟草生 产推广要求相同。各处理形成的小区随机排列，3次重复。
接种菌谷有机药肥施用后20天，按烟草品种抗病性鉴定YC/T41-1996 行业标准中所述的方法接种黑胫病菌谷。接种后，灌半沟水保湿2 3天。
病情调查接种黑胫病菌谷当天按烟草病害调查的行业标准YC/T 39-1996进行一次病情基数调查，40天再调查一次病情，计算病情指数、 防效。
2.结果与分析
大田期防治烟草黑胫病试验效果见表2，从表2可看出本发明菌剂对烟 草黑胫病的防治效果达78.91%，略次于48%甲霜灵锰锌82.50%的防治效 果，但相差不明显。因此，本发明固体颗粒剂可以作为烟草黑胫病的防治药 剂使用。
表2.大田期防治烟草黑胫病试验效果
病情基数 40天的病指增加的病指
相对防治效果(％)
本发明固体颗粒剂 0 48%甲霜灵锰锌 0 空白对照 0
1权利要求
1.一种防治烟草土传真菌病害的木霉固体颗粒剂，其特征在于该菌剂的生产菌株为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)TR13，保藏号CGMCC No.2849。
2. 根据权利要求l所述的木霉固体颗粒剂，其特征在于(1) 所述菌株的培养基配方如下①试管斜面培养基PDA配方为新鲜马铃 薯200g(煮汁，过滤去残渣，留滤液)，蔗糖20g,琼脂I7 20g，蒸馏 水1000ml, pH自然；②液体发酵培养基SDIS配方为大豆蛋白胨10g、 蔗糖10g、酵母粉2g、磷酸二氢钾lg、硫酸镁0.3 g、自来水1000ml、 花生油0.1%、消泡剂0.01%、 pH自然；③固体发酵培养基.RS配方为 稻壳90%， 1 3mni的粗麦麸10%，用矿质无机盐(硫酸氨2g， 磷酸二 氢钾0.5g, 磷酸二氢钠0.5，硫酸镁lg,氯化钙0.5g, 1000ml自来水) 溶液湿润，使其含水量为25%~30%; (2)其菌剂生产釆用液固两相一 步法进行，即液体上生产菌丝、载体上产孢。
3. 根据权利要求1或2所述的木霉固体颗粒剂的制备方法，其特征 在于包括以下步骤(1) 菌种复壮；(2)菌种的制备；(3)液体发酵培养；(4)固体发酵 培养；(5)制剂化。
4. 根据权利要求3所述的木霉固体颗粒剂的制备方法，其特征在于， 所述的菌种复壮是采用以下步骤(1)菌种的活化挑取TR13菌种上少量的孢子粉，点接于新制备、表面无明显冷凝水的 PDA平板上，27.5士rC光照培养2 3天；待长出菌落后，切取生长较快的 菌丝块(尽可能将多余的培养基块削去)，再转接于PDA平板，27.5 土rC光 照培养2 3天，剔除污染的平板，选择菌丝生长较快的平板继续培养，每日 定时观察菌丝的生长与产孢状况，选择生长速度快、产孢量大的平板培养物 作为复壮的出发菌株；(2) 平板对峙培养挑取新鲜的复壮出发菌株孢子粉点接于PDA平板的一侧，距离3 4cm 的另 一侧接种04mm新鲜的立枯丝核菌菌丝块；接种后的平板27.5 ± 1 。C光照培养5 7天，直至复壮的出发菌株的菌丝越过立枯丝核菌的菌丝，并在其上产孢为止；(3)菌种的分离、纯化挑取对峙培养中的复壮出发菌株在立枯丝核菌菌落上产生的孢子于PDA平板上划线分离、纯化，选择生长快的单菌落转接于PDA平板进行纯 培养，再在这些纯培养物中挑选产孢快、产孢量大的培养物，转接PDA斜 面，产孢后的菌种即为复壮的菌种。
5. 根据权利要求3所述的木霉固体颗粒剂的制备方法，其特征在于，所述的菌种的制备是采用以下步骤(1) 平板菌种的培养按无菌操作从活化的平板菌种中，挑取2 4mmx2 4mm的菌丝块，3~5 点点接于平板上，置27.5土rC、光照培养5 7天。在接种后培养的过程中 注意每天定时检查平板，如有污染或生长异常的培养物应及时淘除；平板菌 种的质量标准为无杂菌污染，产孢快、产孢量大，颜色深绿，孢子大小较 一致，轮廓清晰，混有少量菌丝；(2) 液体菌种的制备按无菌操作从制备的平板菌种中，挑取6 8块2 4mmx 2~4mm的菌 丝块，加到装有灭菌PD液的三角瓶中，装液量容积比为30% 50%， 27.5± 1°C、光照、150r/m培养2天；液体菌种的标准为无杂菌，菌体处于旺盛 生长期，菌丝体浓稠。
6. 根据权利要求3所述的木霉固体颗粒剂的制备方法，其特征在于， 所述的液体发酵培养是釆用以下步骤(1 )将液体菌种以2%~5%的体积比接入盛有液体发酵培养基SDIS 的发酵罐中；(2)在28土rC下，以培养基:空气为1:1.6 2.2的体积比 通气，转速120转/分钟搅拌，培养36 42小时；以液体菌丝乳白色、粘 稠，菌丝体干重5mg/mL以上为合格发酵液。
7. 根据权利要求3所述的木霉固体颗粒剂的制备方法，其特征在于， 所述的固体发酵培养是釆用以下步骤(1)接种将合格的发酵液按20%~30%的质量比接种于固体发酵培养基RS[配方为稻壳90%, l~3mm的粗麦麸10%,用矿质无机盐(硫酸氨2g，磷酸二 氢钾0.5g, 磷酸二氢钠0.5,硫酸镁lg,氯化钙0.5g, 1000ml自来水) 溶液湿润，使其含水量为25% 30%。]中。接种时，边加发酵液边搅拌，至 固体物料含水量50%~60%; (2)装盘用底部装有1 2mm的筛网、深4 6cm的不锈钢浅盘盛装，再将浅盘置于培养架上； (3 )培养黑暗培养浅盘中的物料在28土1。C、相对湿度90% 95%的黑暗条件下 培养2 3天，检查物料，发现物料内外布满白色菌丝为合格；光照培养..在每层培养架的顶部加光，24小时光照，在温度为35士rC、 相对湿度50%~60%、对流通风的条件下培养2~3天，每12小时翻盘1次， 检查颗粒状物料布满绿色分生孢子，血球计数板计数每克干物料分生孢子含 量在109个以上的为合格。
8.根'据权利要求3所述的木霉固体颗粒剂的制备方法，其特征在于，所 述的制剂化是釆用以下步骤'.(1 )合格固体培养物45 ± rC干燥12 24小时， 加质量比10% 15%的硅藻土作保护剂；质量比0.1%~0.2%的敌克松原粉作 增效剂；(2)混匀，粉碎成粒径为0.1 0.2mm的颗粒，装袋。
全文摘要
本发明公开了一种防治烟草土传真菌病害的木霉固体颗粒剂及其制备方法。旨在提供一种有效、无毒、安全、无残留、使用简便的生防菌剂。该菌剂的生产菌株为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)TR13，保藏号CGMCC No.2849。其制备方法包括(1)菌种复壮；(2)菌种的制备；(3)液体发酵培养；(4)固体发酵培养；(5)制剂化。
文档编号A01N25/12GK101558766SQ20091009428
公开日2009年10月21日 申请日期2009年4月1日 优先权日2009年4月1日
发明者孔光辉, 力 方, 方敦煌, 革 王, 马永凯 申请人:云南省烟草科学研究所