本发明涉及挥发油制备领域。更具体地说，本发明涉及一种肿节风挥发油的制备方法及其对三七灰霉病的防治作用。
背景技术：
：三七具有显著的活血化瘀、消肿定痛功效，是一种中国传统名贵药材。近年来，对三七原材料的需求日益增长，但是栽培过程中的真菌病害严重影响了三七生长。三七灰霉病以危害叶为主，多从下部老叶的叶尖或近地部分叶柄发病，灰褐色病斑，腐烂。在广西三七的传统产区，由于低海拔及高温多湿的气象条件，这种病害往往更严重，造成了三七的大量减产甚至绝收，给种植户带来了巨大的经济损失。目前，在三七种植上，防治真菌病害过度依赖化学农药，大量化学农药的使用不仅影响了三七的品质，也造成了三七药材的大量农药残留。因此，借鉴中医药研究成果，可望从药用植物中筛选出抗植物病原真菌的天然活性物质，这些活性物质可直接作为天然杀菌剂，效果良好，对三七产业的可持续发展是非常迫切和必要的。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本发明还有一个目的是提供一种肿节风挥发油的制备方法，此方法简单易行，成本低，得率高，用量少；本发明还有一个目的是提供肿节风挥发油的用途，对三七灰霉病的防治作用强，对环境影响小，且药剂药效期长。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种肿节风挥发油的制备方法，包括以下步骤，以下原料按重量份数计：步骤一、取500～600份肿节风的叶和茎，加入5000～6000份水，水蒸气蒸馏得到第一混合物；步骤二、按体积比1:1～2向步骤一中的第一混合物中加入溶剂，萃取，去除溶剂后得挥发油。优选的是，步骤一中的肿节风的叶和茎蒸馏前处理：将500～600份肿节风的叶和茎置于超微粉碎机中粉碎，取出加入500～600份水，置于超声波中以60kHz的频率处理20～30min，取出加入15～20份半胱氨酸和25～30份纤维素酶，调节pH值至5～6，于60℃下酶解24～36h，加入10～15份司班和70～80份吐温，搅拌均匀。优选的是，步骤一中的第一混合物萃取前处理：向步骤一中的第一混合物加入100～120份质量分数为3％的氯化钠溶液和1～1.5份乙酸，混合均匀后放入-18℃环境中冰冻1～1.5h，取出融化。优选的是，步骤二中的挥发油后处理：按体积比1:0.05～0.1:0.05～0.1向步骤二中的挥发油加入吐温和质量分数为15％的魔芋粉溶液，采用磁力搅拌器搅拌，直至混合物呈乳化状态；然后按质量比1:0.02～0.04向混合物中加入β-环糊精，继续用磁力搅拌器搅拌，直至混合物呈黏稠状，即得。本发明还提供了一种由上述的制备方法获得的肿节风挥发油的应用，对三七灰霉病的防治作用。优选的是，挥发油应用于抑制三七灰霉病病原菌菌丝的生长。优选的是，用于抑制三七灰霉病病原菌菌丝生长的挥发油的浓度≥0.5g/L。优选的是，挥发油应用于抑制三七灰霉病病原菌孢子的萌发。优选的是，用于抑制三七灰霉病病原菌孢子萌发的挥发油的浓度为≥0.5g/L。优选的是，挥发油用于三七灰霉病田间防治的使用方法具体为：a按质量体积比为0.5～1g:1000ml将挥发油溶解于稀释剂中，得第一溶解液，稀释剂由吐温和水按体积比为1:3组成；b按体积比为100:1～2向a中的第一溶解液中加入薄荷浆液，搅拌均匀得药液；其中薄荷浆液的制备方法：将10～15份新鲜薄荷和10～15份乙酸乙酯置于研钵中研碎后，过滤即得。本发明至少包括以下有益效果：第一、肿节风挥发油，属于生物农药，与化学农药比对环境影响小；第二、利用超微粉碎手段将肿节风的叶和茎粉碎至10～25μm以下，且在粉碎过程中不会产生局部过热现象，速度快，瞬间即可完成，因而最大限度地保留肿节风的生物活性成分；第三、利用超声波的机械作用促使10～25μm以下的肿节风的叶和茎中的活性物质乳化，有助于其分散至水中；第四、肿节风细胞壁主要是纤维素、半纤维素和果胶类组成，利用纤维素酶酶解其主要组成成分，可破坏其细胞壁，使肿节风的生物活性成分更易流出；第五、植物组织中含有天然的纤维素酶抑制剂，如重金属离子和酚类物质等，半胱氨酸能消除它们的抑制作用，甚至进一步激活纤维素酶，从而缩短肿节风细胞壁酶解时间，提高酶解效率；第六、吐温是一种乳化剂，可以使精油即肿节风挥发油乳化后溶解于水液体中，促进肿节风挥发油从其组织中流出，吐温与其他乳化剂司班合用，可增加乳化剂的稳定性。第七、萃取时油相与水相的界面不清，呈一定强度的乳化区，对肿节风挥发油的得率影响很大，少量无机盐会使乳化作用增强，但当无机盐含量高时，可导致乳化区作用力减弱，导致油水分离，为此加入高浓度的氯化钠溶液和乙酸，可消除肿节风挥发油乳化现象，达到两相快速有效分离；第八、-18℃冻结可使水形成冰晶，肿节风挥发油结晶，使油/水型乳浊液分离，故解冻后，两相分离，有利于肿节风挥发油的萃取；第九、得到肿节风挥发油后，加入吐温使肿节风挥发油乳化后溶解于水液体中，使体系更稳定，再加入魔芋粉溶液，在其乳化区形成一层保护膜层，减缓肿节风挥发油的挥发速度，然后加入β-环糊精，并充分搅拌至乳化状态，即形成肿节风挥发油包合物，使其更易保藏，延长其有效期；第十、将肿节风挥发油用于防治三七灰霉病时，用吐温、水和新鲜薄荷浆液稀释，薄荷中含有丰富的黄酮类物质，其具有较强的抗菌作用，与肿节风挥发油一起具有协同作用，相互增强其对三七灰霉病的防治作用，减少施药用量和次数，节约成本。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。<实施例1>肿节风挥发油的制备方法，包括以下步骤：步骤一、称取500g肿节风的叶和茎放入蒸馏烧瓶中，加入5000g水和8粒沸石，再将蒸馏烧瓶与加热器、冷凝管、接液管和接液器等连接组成蒸馏装置，冷凝管通入自来水，使蒸馏烧瓶内液体保持微沸状态，蒸馏5h后，接液器收集到的油水混合物，即为第一混合物；步骤二、按体积比1:1.5向步骤一中的第一混合物中加入乙醚萃取，分离乙醚层，剩下的水层再按体积比为1:1.5加入乙醚萃取，分离乙醚层，共萃取2次，将乙醚层合并挥发去除乙醚后得挥发油，置于4℃冰箱中保存备用。<实施例2>肿节风挥发油的制备方法，包括以下步骤：步骤一、称取600g肿节风的叶和茎放入蒸馏烧瓶中，加入6000g水和12粒沸石，再将蒸馏烧瓶与加热器、冷凝管、接液管和接液器等连接组成蒸馏装置，冷凝管通入自来水，使蒸馏烧瓶内液体保持微沸状态，蒸馏6h后，接液器收集到的油水混合物，即为第一混合物；步骤二、按体积比1:2向步骤一中的第一混合物中加入丙酮萃取，分离丙酮层，剩下的水层再按体积比为1:2加入丙酮萃取，分离丙酮层，共萃取2次，将丙酮层挥发去除丙酮后得挥发油，置于4℃冰箱中保存备用。<实施例3>肿节风挥发油的制备方法，包括以下步骤：步骤一、称取500g肿节风的叶和茎放入蒸馏烧瓶中，加入5000g水和8粒沸石，再将蒸馏烧瓶与加热器、冷凝管、接液管和接液器等连接组成蒸馏装置，冷凝管通入自来水，使蒸馏烧瓶内液体保持微沸状态，蒸馏5h后，接液器收集到的油水混合物，即为第一混合物；步骤二、按体积比1:1向步骤一中的第一混合物中加入乙酸乙酯萃取，分离乙酸乙酯层，剩下的水层再按体积比为1:1加入乙酸乙酯萃取，分离乙酸乙酯层，共萃取2次，将乙酸乙酯层挥发去除乙酸乙酯后得挥发油，置于4℃冰箱中保存备用。<实施例4>肿节风挥发油的制备方法，包括以下步骤：步骤一、称取500g肿节风的叶和茎置于超微粉碎机中粉碎，取出加入550g水，置于超声波中以60kHz的频率处理25min，取出加入18g半胱氨酸和28g纤维素酶，调节pH值至5.5，于60℃下酶解30h，加入12g司班和75g吐温，搅拌均匀，得第一原料；将第一原料放入蒸馏烧瓶中，加入5000g水和8粒沸石，再将蒸馏烧瓶与加热器、冷凝管、接液管和接液器等连接组成蒸馏装置，冷凝管通入自来水，使蒸馏烧瓶内液体保持微沸状态，蒸馏5h后，接液器收集到的油水混合物，即为第一混合物；步骤二、将步骤一中的第一混合物加入110g质量分数为3％的氯化钠溶液和1.2g乙酸，混合均匀后放入-18℃环境中冰冻1.2h，取出融化，得第二混合物；按体积比1:1.5向第二混合物中加入乙醚萃取，分离乙醚层，剩下的水层再按体积比为1:1.5加入乙醚萃取，分离乙醚层，共萃取2次，将乙醚层合并挥发去除乙醚后得挥发油；<实施例5>肿节风挥发油的制备方法，包括以下步骤：步骤一、称取600g肿节风的叶和茎置于超微粉碎机中粉碎，取出加入600g水，置于超声波中以60kHz的频率处理30min，取出加入20g半胱氨酸和30g纤维素酶，调节pH值至6，于60℃下酶解36h，加入15g司班和80g吐温，搅拌均匀，得第一原料；将第一原料放入蒸馏烧瓶中，加入6000g水和12粒沸石，再将蒸馏烧瓶与加热器、冷凝管、接液管和接液器等连接组成蒸馏装置，冷凝管通入自来水，使蒸馏烧瓶内液体保持微沸状态，蒸馏6h后，接液器收集到的油水混合物，即为第一混合物；步骤二、将步骤一中的第一混合物加入120g质量分数为3％的氯化钠溶液和1.5g乙酸，混合均匀后放入-18℃环境中冰冻1.5h，取出融化，得第二混合物；按体积比1:2向第二混合物中加入丙酮萃取，分离丙酮层，剩下的水层再按体积比为1:2加入丙酮萃取，分离丙酮层，共萃取2次，将丙酮层挥发去除丙酮后得挥发油；<实施例6>肿节风挥发油的制备方法，包括以下步骤：步骤一、称取500g肿节风的叶和茎置于超微粉碎机中粉碎，取出加入500g水，置于超声波中以60kHz的频率处理20min，取出加入15g半胱氨酸和25g纤维素酶，调节pH值至5，于60℃下酶解24h，加入10g司班和70g吐温，搅拌均匀，得第一原料；将第一原料放入蒸馏烧瓶中，加入5000g水和8粒沸石，再将蒸馏烧瓶与加热器、冷凝管、接液管和接液器等连接组成蒸馏装置，冷凝管通入自来水，使蒸馏烧瓶内液体保持微沸状态，蒸馏5h后，接液器收集到的油水混合物，即为第一混合物；步骤二、将步骤一中的第一混合物加入100g质量分数为3％的氯化钠溶液和1g乙酸，混合均匀后放入-18℃环境中冰冻1h，取出融化，得第二混合物；按体积比1:1向第二混合物中加入乙酸乙酯萃取，分离乙酸乙酯层，剩下的水层再按体积比为1:1加入乙酸乙酯萃取，分离乙酸乙酯层，共萃取2次，将乙酸乙酯层挥发去除乙酸乙酯后得挥发油；<实施例7>按实施例4的方法制备肿节风挥发油，按体积比1:0.08:0.06向肿节风挥发油加入吐温和质量分数为15％的魔芋粉溶液，采用磁力搅拌器搅拌，直至混合物呈乳化状态；其中，魔芋粉溶液为将魔芋粉溶于水中制得；然后按质量比1:0.03向混合物中加入β-环糊精，继续用磁力搅拌器搅拌，直至混合物呈黏稠状，置于4℃冰箱中保存备用。<实施例8>按实施例5的方法制备肿节风挥发油，按体积比1:0.1:0.1向肿节风挥发油加入吐温和质量分数为15％的魔芋粉溶液，采用磁力搅拌器搅拌，直至混合物呈乳化状态；其中，魔芋粉溶液为将魔芋粉溶于水中制得；然后按质量比1:0.04向混合物中加入β-环糊精，继续用磁力搅拌器搅拌，直至混合物呈黏稠状，置于4℃冰箱中保存备用。<实施例9>按实施例6的方法制备肿节风挥发油，按体积比1:0.05:0.05向肿节风挥发油加入吐温和质量分数为15％的魔芋粉溶液，采用磁力搅拌器搅拌，直至混合物呈乳化状态；其中，魔芋粉溶液为将魔芋粉溶于水中制得；然后按质量比1:0.02向混合物中加入β-环糊精，继续用磁力搅拌器搅拌，直至混合物呈黏稠状，置于4℃冰箱中保存备用。<实施例10>按实施例7的方法制备，a按质量体积比为0.8g:1000ml将挥发油溶解于稀释剂中，得第一溶解液，稀释剂由吐温和水按体积比为1:3组成；b按体积比为100:1.5向a中的第一溶解液中加入薄荷浆液，搅拌均匀得药液；其中薄荷浆液的制备方法：将12g新鲜薄荷和12g乙酸乙酯置于研钵中研碎后，过滤即得。<实施例11>按实施例8的方法制备，a按质量体积比为1g:1000ml将挥发油溶解于稀释剂中，得第一溶解液，稀释剂由吐温和水按体积比为1:3组成；b按体积比为100:2向a中的第一溶解液中加入薄荷浆液，搅拌均匀得药液；其中薄荷浆液的制备方法：将15g新鲜薄荷和15g乙酸乙酯置于研钵中研碎后，过滤即得。<实施例12>按实施例9的方法制备，a按质量体积比为0.5g:1000ml将挥发油溶解于稀释剂中，得第一溶解液，稀释剂由吐温和水按体积比为1:3组成；b按体积比为100:1向a中的第一溶解液中加入薄荷浆液，搅拌均匀得药液；其中薄荷浆液的制备方法：将10g新鲜薄荷和10g乙酸乙酯置于研钵中研碎后，过滤即得。<得率试验>按实施例1～3和实施例4～6的方法制备肿节风挥发油，用下述公式计算挥发油得率。得率＝肿节风挥发油质量/肿节风的叶和茎的质量×100％表1肿节风挥发油的得率数据显示，实施例4～6的得率明显高于实施例1～3的利率，可见利用超微粉碎手段可最大限度地保留肿节风的生物活性成分，超声波的机械作用促使肿节风的叶和茎中的活性物质乳化，分散至水中，再与纤维素酶酶解细胞壁作用和吐温、司班乳化作用结合，使肿节风的生物活性成分更多的从其组织中流出，萃取时油相与水相的界面不清，呈一定强度的乳化区，对肿节风挥发油的得率影响很大，少量无机盐会使乳化作用增强，但当无机盐含量高时，可导致乳化区作用力减弱，导致油水分离，为此加入高浓度的氯化钠溶液和乙酸，可消除肿节风挥发油乳化现象，达到两相快速有效分离，-18℃冻结可使水形成冰晶，肿节风挥发油结晶，使油/水型乳浊液分离，故解冻后，两相分离，有利于肿节风挥发油的萃取，综合作用下，可使肿节风挥发油得率提高。表1肿节风挥发油的得率<病原菌抑制试验>一、肿节风挥发油对三七灰霉病病原菌菌丝的抑制采用生长速率法测定肿节风挥发油对三七灰霉病病原菌菌丝的抑制作用：用未冷却的PDA培养基将挥发油稀释不同浓度：0.0625g/L、0.125g/L、0.5g/L和1g/L，按质量体积比50μg:1ml向不同浓度的肿节风挥发油中加入吐温80助溶混合，然后分别倒入直径为9cm培养皿中，每个培养皿10ml，制成含药平板，每个处理3次重复，以溶剂为对照。接种直径为9mm的三七灰霉病病原菌菌饼到含药培养基平板中央，置于28℃培养箱培养120h后用十字交叉法测量各处理的菌落直径，减去接种菌饼直径，求出3次重复的平均值，得出各处理的平均菌落扩展直径，用下述公式计算抑制率。抑制率＝(对照菌落扩展直径-处理菌落扩展直径)/对照菌落扩展直径×100％表2不同浓度挥发油对三七灰霉病菌菌丝的抑制率数据显示，实施例1～3的方法制备的肿节风挥发油浓度为0.5g/L及以上时对三七灰霉病病原菌菌丝的抑制率达100％；实施例4～9的方法制备的肿节风挥发油浓度为0.125g/L及以上时对三七灰霉病病原菌菌丝的抑制率达100％；肿节风挥发油浓度同为0.0625g/L时，实施例1～3的方法制备的肿节风挥发油对三七灰霉病病原菌菌丝的抑制率为30％左右，而实施例4～9的方法制备的肿节风挥发油对三七灰霉病病原菌菌丝的抑制率为76％左右。可见，采用实施例4～9的方法制备的肿节风挥发油对三七灰霉病病原菌菌丝的抑制作用比实施例1～3的方法制备的肿节风挥发油更强。表2不同浓度挥发油对三七灰霉病病原菌菌丝的抑制率二、肿节风挥发油对三七灰霉病病原菌孢子萌发的抑制采用悬滴法测定肿节风挥发油对孢子萌发的抑制作用：将三七灰霉病病原菌培养一定时间后使其产孢，加无菌水配置成10倍物镜下每视野50个孢子的孢子悬浮液，以孢子悬浮液为溶剂，分别配置50ml不同浓度的肿节风挥发油，0.0625g/L、0.125g/L、0.5g/L和1g/L，每个处理3次重复，以孢子悬浮液为对照，3次重复，于28℃下保湿培养，24h后检查孢子萌发情况，计算孢子萌发抑制率；萌发抑制率＝(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率×100％表3不同浓度挥发油对三七灰霉病菌孢子萌发的抑制率数据显示，实施例1～3的方法制备的肿节风挥发油浓度为0.5g/L及以上时对三七灰霉病病原菌菌丝的抑制率达95％以上；实施例4～9的方法制备的肿节风挥发油浓度为0.125g/L及以上时对三七灰霉病病原菌孢子萌发的抑制率达97％以上；肿节风挥发油浓度同为0.0625g/L时，实施例1～3的方法制备的肿节风挥发油对三七灰霉病病原菌孢子萌发的抑制率为44％左右，而实施例4～9的方法制备的肿节风挥发油对三七灰霉病病原菌孢子萌发的抑制率为74％左右。可见，采用实施例4～9的方法制备的肿节风挥发油对三七灰霉病病原菌孢子萌发的抑制作用比实施例1～3的方法制备的肿节风挥发油更强。表3不同浓度肿节风挥发油对三七灰霉病病原菌孢子的抑制作用由表2和表3数据说明利用超微粉碎手段可最大限度地保留肿节风的生物活性成分，超声波的机械作用促使肿节风的叶和茎中的活性物质乳化，分散至水中，再与纤维素酶酶解细胞壁作用和吐温、司班乳化作用结合，使肿节风的生物活性成分更多的从其组织中流出，综合作用下使得到的肿节风挥发油活性更强，对三七灰霉病病原菌及孢子的抑制作用更强。<对比试验>按实施例1、实施例4和实施例7的方法制备的肿节风挥发油，以多菌灵为对比例1、腐霉利为对比例2、嘧霉胺为对比例3，肿节风挥发油配制成0.5g/L的浓度，参照三种供试化学杀菌剂的使用说明，用无菌水将化学杀菌剂稀释至相应浓度，并按照生长速率测定法测定肿节风挥发油和化学杀菌剂对灰霉病病原菌菌丝的生长和孢子萌发的抑制作用，以无菌水为对照。如表4数据可以看出按实施例1、实施例4和实施例7的方法制备的肿节风挥发油对菌丝的抑制率明显比多菌灵和腐霉利强，达到100％，与嘧霉胺效果一致，而对孢子萌发的抑制，按实施例1、实施例4和实施例7的方法制备的肿节风挥发油达95％以上明显高于其余三种化学杀菌剂。表4化学药剂对三七灰霉病病原菌及孢子的抑制药剂对菌丝的抑制率％对孢子萌发的抑制率％实施例110095.23实施例410099.83实施例710099.88多菌灵91.0186.50腐霉利95.0290.60嘧霉胺10090.72无菌水00<三七灰霉病防治田间试验>按实施例1、实施例4和实施例7的方法制备的肿节风挥发油先用质量分数为75％的乙醇与肿节风挥发油按照1:1混合均匀，再用清水稀释至浓度为0.5g/L，按实施例10的方法制备，再用清水稀释至肿节风挥发油浓度为0.5g/L，分三个用药频率查看三七灰霉病发病情况和防治效果：(一)在病害发生初期每隔7d喷一次，连续施药3次，以不施用任何药剂为空白对照，每小区面积为20m2，重复3次。分别于用药前1天和用药后7d调查田间发病情况，调查时每小区取5点，每点10株，调查叶片发病情况，统计病情指数和防治效果。(二)在病害发生初期每隔10d喷一次，连续施药3次，以不施用任何药剂为空白对照，每小区面积为20m2，重复3次。分别于用药前1天和用药后10d调查田间发病情况，调查时每小区取5点，每点10株，调查叶片发病情况，统计病情指数和防治效果。(三)在病害发生初期每隔15d喷一次，连续施药3次，以不施用任何药剂为空白对照，每小区面积为20m2，重复3次。分别于用药前1天和用药后15d调查田间发病情况，调查时每小区取5点，每点10株，调查叶片发病情况，统计病情指数和防治效果。病情严重度按0～4级标准分。0级：叶片无病斑；1级：发病面积占整个叶面积的10％以下；2级：发病面积占整个叶面积的10％～29％；3级：发病面积占整个叶面积的30％～50％；4级：发病面积占整个叶面积的50％以上。根据调查结果，按照下面公式计算病情指数及防治效果，统计分析防治效果差异。病情指数＝∑(病级叶片数×代表数值)/(调查叶片总数×发病最重级别的代表数值)×100％防治效果＝(1-CK0×PT1/CK1×PT0)×100％CK0——空白对照区施药前病情指数；CK1——空白对照区施药后病情指数；PT0——肿节风挥发油处理区施药前病情指数；PT1——肿节风挥发油处理区施药后病情指数。表5数据显示，肿节风挥发油对三七灰霉病有较好的防治效果，实施例1、实施例4、实施例7和实施例10的方法制备的肿节风挥发油用药周期为7d时，三七灰霉病病情指数均在5.0以下，防治效果均在87％以上；用药周期改为10d时，实施例1和实施例4的三七灰霉病病情指数明显上升，防治效果明显降低，而实施例7和实施例10的三七灰霉病病情指数和防治效果无明显变化；用药周期为15d时，实施例1和实施例4的三七灰霉病病情指数分别为8.6和7.7，防治效果分别为67.97％和76.07％，而实施例7和实施例10的三七灰霉病病情指数均在5.0以下，防治效果均在86％以上，可以保证杀菌效果；可见实施例7和实施例10中，得到肿节风挥发油后，加入吐温使肿节风挥发油乳化后溶解于水液体中，使体系更稳定，再加入魔芋粉溶液，在其乳化区形成一层保护膜层，减缓肿节风挥发油的挥发速度，然后加入β-环糊精，并充分搅拌至乳化状态，即形成肿节风挥发油包合物，使其更易保藏，延长其有效期；实施例10将肿节风挥发油用于防治三七灰霉病时，用吐温、水和新鲜薄荷浆液稀释，薄荷中含有丰富的黄酮类物质，其具有较强的抗菌作用，与肿节风挥发油一起具有协同作用，相互增强其对三七灰霉病的防治作用。表5肿节风挥发油对三七灰霉病的田间防治效果<对比试验>实施例1、实施例4、实施例7和实施例10的方法制备的肿节风挥发油，以多菌灵为对比例1、腐霉利为对比例2，嘧霉胺为对比例3，进行田间小区防治试验。三种化学杀菌剂按照其商品包装使用说明，用清水稀释相应倍数，喷雾使用；按实施例1，实施例4和实施例7的方法制备的肿节风挥发油先用质量分数为75％的乙醇与肿节风挥发油按照1:1混合均匀，再用清水稀释至浓度为0.5g/L，实施例10的方法制备，再用清水稀释肿节风挥发油至浓度为0.5g/L。在病害发生初期每隔7d喷一次，连续施药3次，以不施用任何药剂为空白对照，每小区面积为20m2，重复3次。分别于用药前1天和用药后7d调查田间发病情况，调查时每小区取5点，每点10株，调查叶片发病情况，统计病情指数和防治效果。病情严重度按0～4级标准分。0级：叶片无病斑；1级：发病面积占整个叶面积的10％以下；2级：发病面积占整个叶面积的10％～29％；3级：发病面积占整个叶面积的30％～50％；4级：发病面积占整个叶面积的50％以上。根据调查结果，按照下面公式计算病情指数及防治效果，统计分析防治效果差异。病情指数＝∑(病级叶片数×代表数值)/(调查叶片总数×发病最重级别的代表数值)×100％防治效果＝(1-CK0×PT1/CK1×PT0)×100％CK0——空白对照区施药前病情指数；CK1——空白对照区施药后病情指数；PT0——肿节风挥发油处理区施药前病情指数；PT1——肿节风挥发油处理区施药后病情指数。表6数据显示，实施例1、实施例4、实施例7和实施例10对三七灰霉病的病情指数比多菌灵、腐霉利和嘧霉胺低，防治效果好。说明肿节风挥发油对三七灰霉病的防治作用强。表6肿节风挥发油与化学杀菌剂对三七灰霉病的田间防治效果尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。当前第1页1 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