专利名称：：前胡香豆素Ⅲ在诱导水稻抗稻瘟病和抗寒性中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于天然药物化学及生物农药
技术领域：
，具体地涉及一种前胡香豆素III在诱导水稻抗稻瘟病和抗寒性中的应用。
背景技术：
：稻瘟病是一种水稻真菌病害，分布世界各水稻产区。严重影响全球水稻的高产稳产。人们对病害的防治主要采取化学防治和抗病育种综合防治的措施，但化学防治病害给人类带来的副作用及对环境的污染和病原菌产生的抗药性问题，一直困扰着人类；培育水稻抗病品种需要时间长，且抗病品种在推广种植35年后就丧失对稻瘟病的抗性，从而引起稻瘟病爆发和流行。植物诱导抗病性是国际上近期兴起的重要农业研究领域，利用植物诱导抗病性被认为是植物保护的新途径和新技术。植物抗病性诱导剂(简称诱抗剂)是一类新型的生物农药，本身并无杀菌活性，但它能激发植物产生系统获得性抗性，激发植物内部的免疫机制，起到抗病、防病、治病的目的。水稻的寒害是影响其高产优质低耗的重要限制因素。水稻起源于热带，属喜温作物。在其生长发育过程中，温度过低能抑制其正常发育，造成减产减收。抗寒剂的研制目前在国内比较普遍，抗寒剂处理在玉米、棉花、水稻等作物上都有广泛的应用，利用植物生长调节剂来提高水稻的抗寒性也有大量的研究。而植物源抗寒剂具有与环境相容性好、使用安全、成本低等优点，也开始受到关注。因此对水稻稻瘟病和寒害以及诱导抗性的研究就成为今天研究的热点，迫切需要寻找到一些诱导物质，它们能激发植物自身的免疫系统来达到抗病抗寒的目的。
发明内容本发明的目的在于提出一种香豆素类化合物前胡香豆素III在诱导水稻抗稻瘟病和抗寒性中的应用。本发明进一步还提供一组以该香豆素类化合物为活性成分的，用于提高水稻抗寒能力的化合物组合物。本发明的前胡香豆素III具有以下结构式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>前胡香豆素III这类化合物分布在植物界的许多种植物中，可以从植物中提取分离制备而得，也可以用化学合成方式获得。中药是我国的国粹，在治病强身方面有着神奇的疗效已被世界所承认。有些中药在植物病虫害的防治方面有着很好的优势，我们花了数年时间，从六十多种中药中经过层层筛选，发现了前胡对水稻稻瘟病的诱导抗病性以及对水稻的抗寒性，并通过活性追踪法从中分离了香豆素类化合物可明显的诱导水稻抗稻瘟病，又通过确证性实验证明，该香豆素类化合物具有诱导水稻抗寒性的作用。本发明提出的化合物组合物含有防治有效量的香豆素类化合物如前胡香豆素III为活性成分，以及含有一种或多种化工上可接受的载体。其中，活性成分的重量含量为0.1-99.9%。上文所述化工上可接受的载体系指满足下述条件的物质它与活性成分配制后便于施用于待处理的位点，例如可以是植物、种子或土壤；或者有利于贮存、运输或操作。载体可以是农药剂型加工领域常规的农药载体，例如分散剂、润湿剂、粘结剂、表面活性剂、助剂等农业上可接受的载体，这些分散剂、润湿剂、粘结剂、表面活性剂、助剂各有特性，本领域的技术人员是可以知道的。本发明化合物可经稀释后直接喷雾于植物的表面来诱导植物产生抗病性和抗寒性。香豆素类化合物前胡香豆素III在1100mg/L的质量浓度范围内处理水稻可以减轻水稻幼苗稻瘟病和水稻寒害的发生且对水稻安全。本发明的化合物的各种剂型可以按照农药剂型加工领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。对于前胡香豆素III的提取可以按已有的方法提取，如按实施例1所述的进行，关于浸提的时间和温度，冷浸是在室温下浸提24h，而加热回流是lh/次，不同的溶剂沸点不同，对于溶剂的性质，本领域的技术人员是容易知道的，因而所采用的温度条件也随溶剂不同而进行调整。具体的实施方式下面的实施例是对本发明的进一步说明，以下是室内生物测定的结果，但无论怎样都不应看作是以任何方式对本发明的应用范围进行的限制。实施例1制备前胡香豆素III4前胡粉碎成粉取样量10倍石油醚冷浸提3-4次滤渣滤液(油脂及蜡质弃去)用10倍量的丙酮溶剂加热回流浸提3-4次合并滤液减压浓縮冷冻干燥(W5-l)过硅胶柱(f油醚/乙酸乙酯梯度洗脱)AlA2A3A4A5A6A7共7个流分活性追踪，r，'，SephadexLH-20反复分离纯化、制备液相ABC重结-曰-曰曰，'聿Q-lQ-2Q隱3通过功能基的测定和紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱、质谱等波谱分析技术对Q-l进行了化学结构鉴定，其分子量为386，为香豆素类化合物peucedanoco咖arinIII(前胡香豆素III)。实施例2诱导水稻抗稻瘟病的实验方法育苗塑料钵23X47cm，装稻田土至钵高的2/3。将健康无病的水稻品种T优180的种子浸于1%质量浓度的灭菌净中24小时，自来水漂洗至24小时。然后置于25t:培养箱中(黑暗)催芽48小时。选取幼芽一致水稻苗播于盛有稻田土的塑料钵中，在温度2426t:，每日14小时光照(11000Lux)的生长室中培养。将上述提取的前胡香豆素III配置成I为100mg/L，II为50mg/L，III为10mg/L各3个质量浓度系列的溶液，pH接近中性，加入0.05%吐温-80(v/v)喷雾至3叶1心期稻苗上，直至植株叶片全部湿润，用化学诱抗剂好米得0.15g/钵作药剂对照，空白对照用清水加0.05%(v/v)吐温-80喷雾。2d天后用含稻瘟病菌5X105个孢子/mL(约3060个孢子/目镜)悬浮液均匀喷于稻苗叶片上。在262『C下的恒温暗室内保湿48小时后继续置于同一生长室中培养生长。7天后记载发病株和每株苗发病最严重叶片的病斑数目，病斑分级参考《植病研究方法》中的方法，按0，1，2，3，4，5级分级标准记载病斑分级，计算病株率和每叶平均病斑数。病叶分级根据病斑占叶面积的比例将病情分为0，1，2，3，4，5级，然后计算病情指数及病指下降百分率，结果如表l。表1前胡香豆素III的不同浓度诱导水稻抗稻瘟病的作用5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实验结果表明前胡香豆素III对水稻稻瘟病都有较好的诱抗效果，不同质量浓度处理水稻后，其病株率、每叶平均病斑数和病情指数均明显低于对照。不同质量浓度的前胡香豆素III对水稻稻瘟病的诱抗效果也不同，存在一定的差异性，在供试的3个浓度中，随着浓度的降低，其诱抗效果降低，其中质量浓度在10mg/L时，前胡香豆素III的诱抗效果都超过了50%，与药剂对照好米得诱抗效果相当。实施例3诱导水稻抗寒性的实验方法水稻品种培两优500(a)水稻种子用0.1%的升汞表面灭菌10min，再用自来水、蒸馏水分别冲洗3次后，吸干水分，分装于小烧杯中，分别加入lmg/L，5mg/L，10mg/L，50mg/L，100mg/L的前胡香豆素III(重复3次)，3(TC下浸种48h，取出后用蒸馏水冲洗3次，其间每天更换溶液1次，以同样条件下蒸馏水浸种为对照，然后于30°C黑暗催芽24h，检查发芽数，计算发芽率；再选取芽长一致的种子播于泥土中，每盆100粒，各处理3盆，在光强40001ux，温度25±2°C的人工光照培养箱中培养，每日照光12h，当生长到二叶一心期喷施不同浓度的前胡香豆素III，处理36h后再置于5±rC低温培养箱寒害处理48h，然后检查死苗数，计算死苗率、成苗率，洗净幼苗，除去种子，剪下苗与根，稍晾干，称取苗、根的鲜重，在8(TC下烘48h后称其干重。结果见表2。表2前胡香豆素111处理对水稻的抗寒效果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>前胡香豆素III诱导水稻抗寒性结果表明，不同质量浓度的前胡香豆素III对水稻发芽率没有明显影响，但可不同程度地提高水稻种子的成苗率，而且可提高水稻幼苗的素质。(b)水稻种子用0.1%的升汞表面灭菌10min，再用自来水、蒸馏水分别冲洗3次后，吸干水分，分装于小烧杯中，分别加入50mg/L的前胡香豆素ni，3(TC下浸种48h，取出后用蒸馏水冲洗3次，其间每天更换溶液1次，以同样条件下蒸馏水浸种为对照，然后于28t:黑暗催芽24h，再选取芽长一致的种子播于泥土中，在光强4000Lux，温度25士2。C的人工光照培养箱中培养，每日照光12h，当生长到二叶一心期备用。用上述溶液(与浸种浓度相同)喷洒1次，直到叶面滴水为止，对照喷洒蒸馏水，喷洒36h后，将供试材料分成2组，一组于原培养条件下继续生长，另一组移至5士rC低温培养箱进行低温胁迫处理48h，然后移回原培养室恢复生长3d，分别于药剂处理36h后低温胁迫前，低温胁迫后48h和恢复生长72h后取材制备酶液。实验结果表明前胡香豆素III处理在低温逆境的条件下和恢复生长3d后，对水稻的生理活性变化均有一定的影响。低温逆境后处理幼苗叶绿素和可溶性蛋白质含量比逆境前降低，正常温度下(3(TC)恢复生长3d后叶绿素含量又增加，增加比对照快。幼苗脯氨酸含量在低温逆境下提高，正常温度下恢复生长3d后含量继续提高。同时处理幼苗可促进CAT、SOD、POD3种保护酶的活性提高，增加水稻对低温伤害时的防御效应，保护水稻免受寒冻的伤害。本发明的优点和积极效果诱导水稻抗稻瘟病和抗寒性的效果明显。大量实验表明，经香豆素类化合物前胡香豆素III处理水稻后，水稻的稻瘟病明显减轻，抗寒能力明显增强，水稻叶片中与抗病性和抗寒性相关酶的活性明显升高，具有明显的诱导效应。权利要求前胡香豆素III在诱导水稻抗稻瘟病和抗寒性中的应用，前胡香豆素III活性成分和农药剂型加工上可以接受的载体配比，重量含量为0.1-99.9％，使用浓度为1-100mg/L。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于前胡香豆素III是从植物中提取或化学合成得到。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的前胡香豆素III化合物在诱导水稻抗稻瘟病中的应用。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的前胡香豆素III类化合物在诱导水稻抗寒性中的应用。全文摘要本发明属于天然药物化学及生物农药
技术领域：
，具体为前胡香豆素Ⅲ在诱导水稻抗稻瘟病和抗寒性中的应用。本发明的化合物具有优异的抗病活性，对病原菌无直接的杀菌作用，但具有明显诱导植物自身的免疫系统来达到抗病的作用，特别适合于水稻稻瘟病。本发明的化合物同时具有很好的诱导植物抗寒性作用。文档编号A01P3/00GK101766174SQ200910226639公开日2010年7月7日申请日期2009年12月15日优先权日2009年12月15日发明者刘二明,周小毛,柏连阳,蔡海林,陈桂华申请人:湖南农业大学;湖南人文科技学院