检测水稻广谱抗稻瘟病基因Pike的分子标记及其应用
【专利摘要】本发明公开了检测水稻广谱抗稻瘟病基因Pike的分子标记及其应用，属于分子生物学领域。本发明公开的分子标记为包含DNA片段1、2、3、4、6的分子标记CP?G1328C，包含DNA片段1、2、4、5、6的分子标记CP?G1328T，包含DNA片段1、2、4、6、7的分子标记CP?G1328G’，DNA片段1?7的序列分别如SEQ ID NO.1?7所示。扩增这些分子标记的引物包括Pik?F、Pik?R、G?F、C?R、T?R、G’?R，各引物序列分别如SEQ ID NO.8?13所示。本发明的分子标记或引物可用于水稻抗稻瘟病基因Pike等位基因类型鉴别、种质资源筛选和分子标记辅助选择育种。
【专利说明】
检测水稻广谱抗稻痘病基因 P i ke的分子标巧及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，设及检测水稻广谱抗稻攝病基因 Pike的分子标记及 其应用。
【背景技术】
[0002] 稻攝病（Ma即aporthe OiTzae)是水稻（0;ryza sativa L.)的重要病害之一，全世 界每年约有10%-30%的水稻产量由于稻攝病菌的入侵而遭受损失。生产实践表明，利用抗 稻攝病基因培育水稻抗病新品种是目前防治稻攝病最经济、有效的方法。随着对水稻抗稻 攝病分子机制的研究，目前已经有20多个抗稻攝病基因被克隆，其中Pike位于水稻第11号 染色体长臂末端，是抗性位点P化上的新等位基因，该基因从釉稻品系湘早143(湖南省水稻 研究所）中克隆，接种鉴定发现该基因对水稻稻攝病具有广谱持久抗性，通过MS(分子标记 辅助选择)等手段将该基因导入到R287、日本晴等优质水稻品系中发现，该基因能大幅提高 水稻品系的稻攝病抗性。故而，P化e在水稻的抗病育种中具有很高的应用价值。
[0003] 在水稻基因组中，抗病基因 Pike的稻攝病抗性由两个相邻的NBS-LRR类基因 Pike- 1和Pike-2共同决定，利用多序列比对软件DNAMAN8.0将Pike编码区序列与其他6个P化等位 基因（Pik、P化h、Pikm、P化9、？143、？11)相比较，发现在？11?5-1。0臟序列的第1328位存在着 一个Pike特异性的SNP位点G1328C。在Pike中该SNP位点对应的核巧酸为G，对应的氨基酸为 色氨酸(W)，而在其他6个已克隆的等位基因（P化、Pi化、Pikm、P化口、？143、？11)中该5肥位点 对应的核巧酸为C，编码氨基酸为丝氨酸(S)，故而通过检测SNP位点G1328C对应的核巧酸类 型能有效区分Pike和其他6个已克隆的P化等位基因。然而，通过研究发现自然界中SNP位点 G1328C对应的核巧酸类型并非只存在G、C两种类型，且现有分子标记不能对SNP位点G1328C 对应的其他核巧酸的类型进行有效检测。
【发明内容】
[0004] 本发明随机选取了日本晴、岳泰B、芒恢等杂交稻骨干亲本材料并对Pike-1等位基 因的部分核巧酸序列进行了测序分析，发现根据Pike-1中SNP位点C1328C对应的核巧酸类 型及其侧翼区序列可W将自然界中Pike的等位变异划分为4种类型（6-*796、(：-*796、1'- type、G'-type)，且序列比对发现同种类型中Pike等位基因的核巧酸序列相似度较高，而不 同类型之间的核巧酸序列相似度较低。同时本发明根据此序列分析结果，利用SNP位点 G1328C对应的核巧酸及SNP位点侧翼区核巧酸序列开发出了3个特异性检测Pike的共显性 分子标记，运些共显性分子标记对抗稻攝病基因 Pike的检测具有特异性，同时能有效区分 Pike位点4种类型的等位变异。与前人开发的特异性检测Pike的dCAPS标记d-G1328C相比， 该共显性标记具有检测成本低廉、操作简单、应用范围广的特点。同时，由于运3个分子标记 位于Pike的内部，在MAS育种中，运些分子标记与抗病基因 Pike共分离，和Pike连锁性分子 标记RM224的检测结果相比，运些标记对Pike的检测结果更为准确、可靠。
[0005] 本发明的目的在于提供3个检测水稻广谱抗稻攝病基因 Pike的分子标记。本发明 的目的还在于提供扩增所述分子标记的引物，w及所述分子标记或引物的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] 本发明随机选取了包括93-11、岳泰B在内的12份杂交稻育种骨干亲本，并对运些 材料中的Pike-1等位基因编码区1168bp-1828bp使用引物组合Pik-F和TG-R(表1)进行了 RCR扩增、克隆、测序。经过PCR扩增，从培矮645、1?287、8331113^3、嘉814和丽江新团黑谷5份 材料中获得了长度为661bp的DNA片段，序列比对发现，运5份测序材料及Pik-l、Pi化-1、 Pikm-l、Pikp-l、Piks-l和Pil-5C在该区域与Pike-1的序列相似度达到了99% W上，但在 SNP位点G1328C处，该5份材料与Pikm-1、P化S-1、Pil-l、Pik-l、Pikp-l、PiWi-l 中的核巧酸 一致，全部为碱基C(图1);从93-11、岳泰B、IR6、黄华占及合丰粘5份材料中获得了长度为 640bp的DNA片段，序列比对发现，运5份材料与Pike-1在该区域的序列相似度仅为77.6%- 78 %，但与Pik-Nip(日本晴中P化等位基因）的相似度达到了99%，在SNP位点G1328C处，该5 份材料与Pik-Nip中的核巧酸一致，全部为碱基T;从福恢838和芒恢中获得了长度为670bp 的DNA片段，运2份材料与Pike-1在该区域的序列相似度仅为73.5%，与Pik-Nip的相似度为 73.8%，虽然在G1328C处，来自于运2份材料的等位基因与Pike-1相同（图1)，但是在SNP位 点附近其核巧酸序列与Pike相似度较低。
[0008] 为后续描述方便，本发明根据上述序列分析结果将Pik位点的等位变异划分为4种 类型：1 )G-type: SNP位点G1328C对应的碱基为G，如：Pike; 2)C-type: SNP位点G1328C对应的 碱基为C，如:Pikm-1、P化S-1、Pi 1-1、Pik-l、Pikp-l、P化h-1及来源于培矮64S等5份材料的 P化等位基因；3)T-type: SNP位点G1328C对应的碱基为T，如Pik-Nip及来源于93-11等5份材 料的P化等位基因；4)G'-type:虽然SNP位点G1328C对应的碱基为G，但是核巧酸序列与Pike 的相似度较低，如来源于芒恢和福恢838中的P化等位基因（图1)。
[0009] 本发明根据上述序列分析结果及SNP位点G1328C对应的核巧酸类型，开发出3个能 够特异性检测水稻抗稻攝病基因 Pike的共显性分子标记CP-G1328C、CP-G1328T、CP- G1328G'。其中，分子标记CP-G1328C是使用引物组合Pik-F、Pik-R、G-F和C-R从水稻基因组 中扩增出来的DNA片段，其包含了 DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段6，该 分子标记在Pike(G-type)与C-type等位基因间表现为共显性;分子标记CP-G1328T是使用 引物组合Pik-F、P化-R、G-F和T-R从水稻基因组中扩增出来的DNA片段，其包含了 DNA片段1、 DNA片段2、DNA片段4、DNA片段5和DNA片段6,该分子标记在Pike(G-type)与T-type等位基因 间表现为共显性;分子标记CP-G1328G'是使用引物组合Pik-F、Pik-R、G-F和G '-R从水稻基 因组中扩增出来的DNA片段，其包含了 DNA片段1、DNA片段2、DNA片段4、DNA片段6和DNA片段 7,该分子标记在Pike(G-type)与G'-type等位基因间表现为共显性。DNA片段1-7的序列分 别如沈Q ID NO. 1-7所示。
[0010]扩增上述共显性分子标记包含的片段所使用的引物序列如下：
[0011] Pik-F:5 '-GAAGAATGGGAAGTCATCAGA-3 '；
[0012] Pik-R:5'-ACCTTCTGCTGCTTTCTCTTC-3'；
[0013] G-F:5 '-GATCTAGATAATAATGATGCTTTGTG-3 '；
[0014] C-R:5 '-GCTATCCTCCAAGACATCGA-3 '；
[0015] T-R:5 '-CTTGCTACCTTGTCACACAACA-3 '；
[0016] G'-R:5 '-AGACCTCTCTATTGTACTGT-3 '。
[0017] 上述共显性标记或引物在水稻抗稻攝病基因 Pike等位基因类型鉴别、种质资源筛 选及分子标记辅助选择育种中的应用。
[0018] 对于共显性分子标记CP-G1328C、标记CP-G1328T和标记CP-G1328G'，无论何种类 型的等位基因存在，两个外部引物Pik-F和Pik-R都会扩增出一条共有片段，其中G-type和 C-type等位基因的共有片段长为558bp，T-type和G'-type等位基因的共有片段长度分别为 549bp和576bp。对于分子标记CP-G1328C，当G-type等位基因存在时，引物组合G-F和Pik-R 会扩增出G-type等位基因特异性片段，该片段长度为423bp;而当C-type等位基因存在时， 引物组合Pik-F和C-R会扩增出一条长度为179bp的C-type等位基因特有片段。虽然使用该 标记检测4种等位基因时扩增的DNA片段长度存在差异，但是在使用低浓度琼脂糖凝胶对扩 增产物进行检测时，该分子标记只能在G-type和C-type两种类型的等位基因之间表现出共 显性。
[0019] 其次是共显性分子标记CP-G1328T，当G-type等位基因存在时，引物组合G-F和 P化-R会扩增出条长度为423bp的G-type等位基因特异性片段，而对于C-type等位基因则没 有特异性的片段被扩增出来。对于T-type等位基因，引物组合Pik-F和T-R会扩增出一条 182bp的T-type等位基因特异性片段。在实际应用中，分子标记CP-G1328T仅会在G-type和 T-type等位基因间表现出共显性。
[0020] 对于第3个共显性分子标记CP-G1328G'，该标记在G-type和c-type等位基因中所 能扩增出的DNA片段和分子标记CP-G1328T完全一致。但是当G'-type等位基因存在时，引物 组合G'-R和Pik-F能扩增出一条G'-type等位基因特异性的DNA片段，该DNA片段长度为 19化P。故而，在实际应用中，分子标记CP-G1328G'仅能在Pike (G-type)和G'-type等位基因 之间表现出共显性，而在其他组合间表现出显性。
[0021] 虽然上述3个分子标记是依据同一个SNP位点及其侧翼区所开发的，都能有效的检 ^UPike(G-type)，但是其在Pike不同等位基因类型间的表现不同，故而在实际应用中需根 据水稻材料中所含Pike等位基因的类型进行选择。
[0022] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明的共显性分子标记引物能 够特异性的对水稻基因组DNA进行标记鉴定，检测水稻材料基因组DNA中广谱抗稻攝病基因 Pike的存在状态（纯合或杂合），检测准确性高，与传统的酶切、测序及抗病鉴定等方法相 比，具有成本低廉、耗时少、操作简单的优点。
【附图说明】
[0023] 图1 SNP位点G1328C附近核巧酸序列比对结果图。Mk-l、P化h-1、Pikm-l、Pikp-l、 P化s-l、Pil-5C为已克隆6个Pike-1的等位基因。SNP位点G1328切日黑色方框所示。
[0024] 图2检测Pike等位基因类型的分子标记开发原理图。
[0025] 图3检测共显性分子标记设计结果的琼脂糖凝胶电泳图。a:共显性分子标记CP- G1328C的检测结果；b :共显性分子标记CP-G1328T的检测结果；C :共显性分子标记CP- G1328G' 的检测结果；d: dCAPS标记d-G1328C的检测结果。M:DL2000(hKaRa，Ja吨an); 1:湘 早143(Pike);2:I拙Lkm(Pik-m);3:I拙Lk-ka(Pik);4:I拙Lks-F5(Pik-s);5:IRBLl-CL (Pi 1);6:1邸Lkp-K60(Pik-p); 7: IRBUdi-K3(Pik-h); 8:丽江新团黑谷；9:日本晴；10:培矮 645;11:福恢838;12:岳泰8;13:136;14:8日3111日113;15:嘉814;16:合丰粘；17:芒恢；18: R287〇
[0026] 图4分子标记检测水稻育种株系基因型的电泳图。a分子标记RM224对14份育种株 系基因型检测的电泳图;b分子标记CP-G1328C对14份育种株系基因型检测的琼脂糖凝胶电 泳图。图中由左至右，M:分子量标记DL2000 (TaKaRa Japan); 1:湘早143 (Pike供体）；2 : R287;3:75-1-127;4:B505;5-18:皿1-HD14。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0028] 本发明利用水稻广谱抗稻攝病基因 Pike、Pil、Pik、Piks、Pikm、Pikp、Pildi及部分 材料中Pike-1同源序列在编码区1328位及其侧翼区的核巧酸序列差异（图1)，针对SNP位点 G1328C设计出3个特异性检测Pike (G-type)的分子标记，每个分子标记包含了 5个DNA片段， 其中分子标记CP1-G1328C包含了 DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段6;分 子标记CP-G1328T包含了 DNA片段1、DNA片段2、DNA片段4、DNA片段5和DNA片段6;分子标记 CP-G1328G'包含了 DNA片段1、DNA片段2、DNA片段4、DNA片段6和DNA片段7。相关DNA片段序列 如下：
[00巧]DNA片段1的序列(G-type和C-type的共有DNA片段，长度558bp，沈Q ID N0.1)，
[0030] DM片段2的序列（P化e(G-type)特有片段，长度423bp，沈Q ID N0.2)，
[0031] DM片段3的序列（C-type特有片段，长度179bp，沈Q ID NO.3)，
[0032] DNA片段4的序列（T-type特有片段，长度549bp，沈Q ID N0.4)，
[0033] DNA片段5的序列(T-type特有片段，长度182bp，沈Q ID NO.5)，
[0034] DNA片段6的序列(G'-type特有片段，长度57化p，沈Q ID N0.6)，
[0035] DNA片段7的序列(G，-type特有片段，长度192bp，沈Q ID NO.7)。
[0036] 根据图2中所示的标记开发原理，依据编码区1328位核巧酸类型及SNP位点侧翼区 序列差异，设计了特异性检测Pike的分子标记的引物(表1)。
[0037] 表1本发明中所使用的引物序列及功能信息
[00；3 引
[0039] 实施例1共显性分子标记在区分Pike及其他类型等位基因中的应用
[0040] 本发明使用Pike的供体材料湘早143,含有Pike等位基因的6个单基因系：IRBLkm- Ts(Pikm)、IRB化-Ka(Pik)、IRB化s-F5(Piks)、IRBL1-化（Pi 1)、IRBLkp-K60(P化P)、IRBUdi- K3(Pi化），10个目标区段已测序水稻品系（图1):丽江新团黑谷、培矮64S、福恢838、岳泰B、 IR6、Basmatis、嘉814、合丰粘、芒恢、R287及日本晴（T-type)，对本发明中的分子标记开发 结果进行验证，同时使用dCAI^标记d-Gl 328C作为对照。
[0041] 利用CTAB法提取上述水稻材料的基因组DNA，将扩增每个分子标记所含DNA片段的 4条引物（CP-G1328C:Pik-F、Pik-R、G-F、C-R;CP-G1328T:Pik-F、Pik-R、G-F、T-R;CP- G1328G'：P化-F、P化-R、G-F、G'-R)分别等量混合，而后将混匀后的引物作为PCR扩增体系中 的引物，对上述材料的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增使用2XES Taq Master Mix (CWBI0，Beijing,化 ina)，扩增条件为：94°C5min 预变性后，94°C45s、50°C45 巧日 72°C45s 连 续30个循环；随后72°(：10111111，41：5111111。？〇?产物使用2%的琼脂糖凝胶进行检测，检测结果 见图3。
[0042] 从图3可W看出，对于共显性分子标记CP-G1328C、标记CP-G1328T和标记CP- G1328G'，无论是何种类型的等位基因存在，都会扩增出一条DNA片段，其中G-type(泳道编 号1)和C-type (泳道编号2-8，10、14、15、18)等位基因的DNA片段长为558bp，T-type (泳道编 号9、12、13、16)和6'-*796(泳道编号11、17)等位基因的共有片段长度分别为54机9和 576bp〇
[0043] 对于共显性标记CP-G1328C，在含有等位基因 Pike(G-type)的材料湘早143中，该 共显性标记能够扩增1条Pike(G-type)特有片段(423bp);在含有C-type等位基因的材料 中，能够扩增1条C-type等位基因特有片段（179bp)(图3a)。故而该标记在Pike(G-type)和 C-type等位基因之间表现为共显性。
[0044] 对于共显性标记CP-G1328T，在含有等位基因 Pike(G-type)的材料湘早143中，该 共显性标记能够扩增1条Pike(G-type)特有片段(423bp);在含有T-type等位基因的材料 中，能够扩增1条T-type等位基因特有片段（182bp)(图3b)。故而该标记在Pike (G-type)和 T-type等位基因之间表现为共显性。
[0045] 对于共显性标记CP-G1328G'，在含有等位基因 Pike(G-type)的材料湘早143中，该 共显性标记能够扩增1条Pike (G-type)特有片段(423bp);在含有G'-type等位基因的材料 中，能够扩增1条G ' -type等位基因特有片段（192bp)(图3c)。故而该标记在Pike (G-type)和 G'-type等位基因之间表现为共显性。
[0046] 上述结果表明，运些新开发的共显性分子标记除了可W对Pike和其他已克隆的6 个等位基因（Pil、P化、Pikm、P化s、Pikp、Pi化)进行有效区分，还能有效区分4种不同类型的 Pike-1等位变异，与dCAPS标记d-G1328C(图3d)相比，运3个分子标记的应用范围更广且操 作更为简单。
[0047] 实施例2共显性分子标记在种质资源筛选中的应用
[0048] 本发明中分子标记的另一功能是从稻种资源中筛选含有Pike的抗原材料，为验证 该功能，本发明随机选取了 320份水稻品系，对本发明中的分子标记CP-G1328C、CP-G1328T 和CP-G1328G'的功能进行了验证。通过分子标记检测，在320份材料中，共发现含有G-type 等位基因的材料1份，含有C-type等位基因的材料129份，含有T-type等位基因的材料131 份，含有G ' -type等位基因的材料59份。
[0049] 由于酶切是检测SNP位点的最有效方法之一，dCAPS标记d-G1328C被用来检验本发 明中的分子标记对320份材料SNP位点G1328C检测的准确性，结果表明本发明的分子标记对 上述材料的检测结果正确。由于d-G1328C在含有T-type和G'-type等位基因的材料中不能 有效扩增，本发明随机选取了 13份T-type和6份G'-type水稻品系进行了测序，测序结果证 实了本发明中分子标记对上述材料的检测结果正确。
[0050] 由于本发明中分子标记为特异性检测Pike的共显性分子标记，为了验证标记对 Pike检测的特异性，本发明对筛选出的含有G-type等位基因材料898B中的Pike-1使用3对 扩增片段具有重叠的引物对化6-巧、邸-11?，邸-2。、邸-21?，邸-3。、邸-310(表1)进行了？〇?扩 增、测序，并将测序结果与Pike的核巧酸序列进行比较，结果发现，水稻品系898B中确实含 有广谱抗稻攝病基因 Pike。
[0051] 上述结果表明，本发明中的分子标记能够特异性的检测Pike,同时本发明中的分 子标记能够有效区分PA位点4种不同类型(G-type、C-type、T-type、G '-type)的等位基因， 且扩增条带清晰明亮、检测方法简单，故而能够有效应用在水稻的抗病育种中。
[0052] 实施例3共显性分子标记在分子标记辅助选择育种中的应用
[0053] 本发明选取了由湘早143(Pike抗原)衍生的14份水稻育种株系HD1-HD14,对本发 明中的分子标记在抗病育种中的功能进行了验证。首先使用与Pike紧密连锁的分子标记 RM224对育种株系进行检测，检测结果表明14个育种株系中都含有Pike(图4曰）。但使用本发 明中的分子标记CP-G1328C鉴定发现，育种株系皿5、皿12、皿13、皿14中无广谱抗稻攝病基 因 Pike(图4b)。为了验证两个标记的检测结果，在湖北恩施采用自然诱发法对R287、湘早 143及育种株系HD1-HD14进行了稻攝病抗性评估(表2)，对比分子标记检测结果发现，本发 明中分子标记所检测的基因型结果与抗性鉴定表型结果相符合。此结果表明，相对于Pike 连锁性的分子标记RM224,本发明中的分子标记对Pike的鉴定结果更为准确。
[0054]表2水稻育种株系稻攝病抗性评估及分子标记检测结果
[0化5]
[0056] R:抗病;MR:中抗;MS:中感;S:感病。V'Pike检测阳性；Pike检测阴性。
[0057]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 检测水稻广谱抗稻瘟病基因 Pik的分子标记，其特征在于：为〇?-61328(：、〇?-G1328T、CP-G1328G' ；其中，分子标记CP-G1328C包含了DNA片段 1、DNA片段2、DNA片段3、DNA 片段4、DNA片段6;分子标记CP-G1328T包含了 DNA片段1、DNA片段2、DNA片段4、DNA片段5、 DNA片段6;分子标记CP-G1328G '包含了DNA片段1、DNA片段2、DNA片段4、DNA片段6、DNA片段 7;DNA片段1-7的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1-7所示。2. 扩增权利要求1所述的分子标记的引物，其特征在于:为Pi k-F、P ik-R、G-F、C-R、T-R、 G'-R，各引物序列如下： Pik-F:5，-GAAGAATGGGAAGTCATCAGA-3，； Pik-R:5 '-ACCTTCTGCTGCTTTCTCTTC-3 '； G-F:5 '-GATCTAGATAATAATGATGCTTTGTG-3 '； C-R:5 '-GCTATCCTCCAAGACATCGA-3 '； T-R:5 '-CTTGCTACCTTGTCACACAACA-3 '； G '-R:5 '-AGACCTCTCTATTGTACTGT-3 '； 其中，引物组合Pik-F、Pik-R、G-F和C-R用于扩增分子标记CP-G1328C，引物组合Pik-F、 Pik-R、G-F和T-R用于扩增分子标记CP-G1328T，引物组合Pik-F、Pik-R、G-F和G'-R用于扩增 分子标记CP-G1328G'。3. 权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物在水稻抗稻瘟病基因 Pi如等位 基因类型鉴别、种质资源筛选、分子标记辅助选择育种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK106048069SQ201610674761
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月16日 公开号201610674761.4, CN 106048069 A, CN 106048069A, CN 201610674761, CN-A-106048069, CN106048069 A, CN106048069A, CN201610674761, CN201610674761.4
【发明人】章志宏, 何永刚, 孟芬, 张利攀
【申请人】武汉大学