一种稻瘟病菌分生孢子的培养制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种稻瘟病菌分生孢子的培养制备方法，该方法利用多起点培养技术，以及气生菌丝产孢技术，快速培养制备稻瘟病菌分生孢子。该方法实施步骤如下：1)产孢培养基的制备；2)多起点移植菌体的配备；3)将多起点移植菌体植入培养平板；4)孢子制备培养；5)孢子的洗脱分离。本发明的特色与优点是：1)快速高效，通常培养5天后新一代孢子能达到高产孢量的理想状态；2)制备培养全程能保持无菌操作，成品孢子液的污染机率大幅降低；3)操作技术简单，结果产孢量大。
【专利说明】
一种稻瘟病菌分生孢子的培养制备方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及植物病理学技术和微生物学技术。具体是一种稻痕病菌分生孢子的培养制备方法。
【背景技术】
[0002]植物病原真菌的繁殖体除了具有繁殖扩大自身种群数量的基本作用外，更重要的是拥有与寄主互作识别，并发动侵染寄主的功能，因此在大多数植物病害的研究过程中，都需要使用病原菌的繁殖体作试验材料，显而易见，高效便捷的繁殖体材料的培养制备方法，将非常有利于研究工作的高效开展。稻瘟病是我国水稻生产的一种重大病害，该病害的病原菌(Magnaporthe grisea)的繁殖体包括有性态的子囊孢子、和无性态的分生孢子二种类型。目前在实验室内制备有性孢子存在较大的技术难度，因此，至今的有关研究所用的繁殖体主要是使用该病菌的分生孢子。
[0003]稻痕病菌分生孢子的培养制备方法可归结为二大类。
[0004]—类是采用植物籽粒作培养基的培养法，即先将植物籽粒(如大麦粒等)浸润并灭菌制成培养基，然后将菌丝体移植入籽粒培养基内培养，当菌丝长满籽粒后，用水洗刷掉籽粒表面菌丝，并转放到方盘类器具内再进行光照培养，整个过程一般需要18天以上。该方法通常能制备大量的分生孢子，不过，培养制备全程时间较长，成品孢子液难以避免杂菌污染，而且存在较多的培养基杂质。
[0005]另一类是采用凝固剂琼脂制成培养基的平板培养法，即先将有关养分(如燕麦汁)与琼脂制成固体培养基并倒成平板，然后将少许菌丝体块移植入培养基平板中间培养，当平板上长满菌丝后，用工具刮除平板表面气生菌丝，并转到光照条件下再培养，整个过程一般需要10?13天以上。该方法能克服前述方法的一些不足，如获得的成品孢子液杂质少，且容易避免杂菌污染。但该方法耗费时间仍有过长之嫌;且长时间的平板培养仍然存在较高的杂菌污染机率;在培养中途需要刮去气生菌丝的技术操作，以及需要提供光照等技术支持，实践应用仍然不方便。因而技术上仍有改进提高的空间。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种稻瘟病菌分生孢子的培养制备方法。
[0007]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
[0008]—种稻瘟病菌分生孢子的培养制备方法，主要是应用多起点培养技术，以及气生菌丝产孢技术，快速培养制备稻瘟病菌分生孢子，培养制备方法的步骤如下:
[0009]1.产孢培养基的制备:按常规方法制备产孢培养基，该培养基的组成为:燕麦167g，琼脂20g，水1000ml;常规高温灭菌，倒入9cm培养皿制成培养平板。
[0010]2.多起点移植菌体的配备:在无菌条件下，用无菌水洗涤常规备存的稻瘟病菌菌落，得到孢子-菌丝碎混合液，用该混合液作为制备新一代分生孢子的多起点移植菌体。
[0011 ] 3.将多起点移植菌体植入培养平板:用微量移液器将步骤2配备的多起点移植菌体移植入步骤I制备的培养平板，并使菌体液在平板面上分散均匀。
[0012]4.孢子制备培养:将步骤3操作完备后的制备培养平板转入温度为28°C、相对湿度为90 %的恒温培养箱内暗培养。
[0013]5.孢子的洗脱分离:通常步骤4培养5天后，新一代分生孢子达到高产孢量的状态；用无菌水将平板上孢子洗脱，并集中到灭菌容器内，即获得较纯净的稻瘟病菌分生孢子液。
[0014]本发明的特色与优点是:
[0015]I)快速高效，通常培养5天后新一代孢子能达到高产孢量的理想状态。
[0016]2)制备培养全程能保持无菌操作，成品孢子液的污染机率大幅降低。
[0017]3)操作技术简单，结果产孢量大。
【附图说明】
[0018]图1是本发明将多起点移植菌体植入培养平板并培养2天后的稻瘟病菌菌落。
[0019]图2是本发明将多起点移植菌体植入培养平板并培养5天后的稻瘟病菌菌落。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图与实施例对本发明作进一步描述。
[0021]本发明所述的产孢培养基是应用燕麦作主要成分的培养基，其组分为:燕麦167g，琼脂20g，水1000ml;组分燕麦为水煮开180分钟后取汁用;培养基经过常规高压高温灭菌后备用。
[0022]本发明所述的多起点移植菌体是指洗涤常规备存的平板菌落所获得的分生孢子与菌丝碎的混合液，该混合液中孢子占大多数，将该混合液移植到培养平板并均匀分散于平板面上，每一个孢子或菌丝片段都可以萌发生长，因而可以在培养平板上形成大量的生长起点，因此，本发明将这种移植方式的菌体液称为多起点移植菌体。大量的生长起点同时生长，就能在培养平板上快速形成均匀的菌落。
[0023]相对而言，常规的移植菌体为一菌丝块，尽管该菌丝块可能含有较多的菌丝片段，但在培养平板面上，病菌是以该菌丝块为中心向四周空白培养基辐射生长，实际相当于只有单一个生长起点。
[0024]多起点移植菌体液内的孢子和菌丝量一般无需准确定量，取一个9cm培养皿的正常菌落加水1ml洗涤获得的菌体液，取其20?50μ1作移植菌体，能满足正常制备培养新一代孢子用的菌体量要求。
[0025]发明人观察发现，在产孢培养过程中，新一代分生孢子形成于菌落表面的气生菌丝上，刮除菌落表面菌丝的技术操作并不能增加产孢量，反而降低产孢量；同样进行光照处理也不能增加产孢量，反而降低产孢量，因而在技术操作上，本发明无需按常规实施刮除菌落表面菌丝，也无需增加光照条件。
[0026]产孢培养环境的相对湿度应维持在90%左右，过低的湿度不利于菌落产孢，也容易导致培养基干燥，实际工作中若利用没有控湿条件的培养箱，可在箱内放置干净的湿毛巾增加湿度；但不宜将湿度提高至近于饱和湿度，因为发明人发现，在近于饱和湿度条件下，该培养技术的产孢效能反而下降。
[0027]通常产孢制备培养2天后可见明显的菌落并形成气生菌丝，如图1所示，培养3天后就能产生新一代孢子，培养5天后菌落表面已形成密集的气生菌丝，并且新一代孢子达到高产孢量的理想状态，如图2所示;另外，此高产孢量状态能维持至培养11天后。
[0028]在制备培养结果的新一代孢子洗脱操作中，若用毛刷类工具刷洗会产生大量的菌丝片段混杂于孢子液中，而用光滑玻棒刷洗获得的孢子液，其中混杂的菌丝片段较少。
[0029]实施例1
[0030]应用本发明一种稻瘟病菌孢子的培养制备方法，培养制备稻瘟病菌菌株Mg2013_l的分生孢子，按如下步骤实施操作:
[0031]1.产孢培养基的制备
[0032]按常规方法制备产孢培养基，该培养基的组成为:燕麦167g，琼脂20g，水1000ml;常规高温灭菌，倒入9cm培养皿制成培养平板。
[0033]2.多起点移植菌体的配备
[0034]在无菌条件下，用1ml无菌水洗涤常规备存的稻瘟病菌菌株Mg2013-1的菌落一皿，得到孢子-菌丝碎混合液，用该混合液作为制备新一代分生孢子的多起点移植菌体。
[0035]3.将多起点移植菌体植入培养平板
[0036]用微量移液器取步骤2配备的多起点移植菌体40μ1移植入步骤I制备的培养平板，用T形玻棒在平板面上轻轻涂抹，使菌体液在平板面上分散均匀。
[0037]4.孢子制备培养:将步骤3操作完备后的制备培养平板转入温度为28°C、相对湿度为90 %的恒温培养箱内暗培养。
[0038]5.孢子的洗脱分离:步骤4培养5天后，新一代分生孢子达到高产孢量的状态;取无菌水15ml将一皿培养平板的新一代孢子洗脱，所获得的分生孢子液，孢子浓度可达1.48X16 个/ml。
[0039]实施例2
[0040]应用本发明一种稻瘟病菌孢子的培养制备方法，培养制备稻瘟病菌菌株Mg2015_7的分生孢子，按实施例1的步骤I至步骤5操作实施，只是步骤2的菌株是Mg2015-7;结果用无菌水15ml洗脱一皿培养平板所获得的新一代分生孢子液，孢子浓度可达1.20 X 16个/ml。[0041 ] 实施例3
[0042]应用本发明一种稻瘟病菌孢子的培养制备方法，培养制备稻瘟病菌菌株Mg2015_
14的分生孢子，按实施例1的步骤I至步骤5操作实施，只是步骤2的菌株是Mg2015-14;结果用无菌水15ml洗脱一皿培养平板所所获得的新一代分生孢子液，孢子浓度可达1.38 X 16个/ml。
【主权项】
1.一种稻痕病菌分生孢子的培养制备方法，其特征在于，利用多起点培养技术，以及气生菌丝产孢技术，快速培养制备稻瘟病菌分生孢子;方法的步骤如下: .1)产孢培养基的制备:按常规方法制备产孢培养基，该培养基的组成为:燕麦167g，琼月旨20g，水100ml;常规高温灭菌，倒入9cm培养皿制成培养平板； .2)多起点移植菌体的配备:在无菌条件下，用无菌水洗涤常规备存的稻瘟病菌菌落，得到孢子-菌丝碎混合液，用该混合液作为制备新一代分生孢子的多起点移植菌体；. 3)将多起点移植菌体植入培养平板:用微量移液器将步骤2)配备的多起点移植菌体移植入步骤I)制备的培养平板，并使菌体液在平板面上分散均匀；. 4)孢子制备培养:将步骤3)操作完备后的制备培养平板转入温度为28°C、相对湿度为90 %的恒温培养箱内暗培养；. 5)孢子的洗脱分离:通常步骤4)培养5天后，新一代分生孢子达到高产孢量的状态；用无菌水将平板上孢子洗脱，并集中到灭菌容器内，即获得较纯净的稻瘟病菌分生孢子液。
【文档编号】C12N3/00GK105861412SQ201610345467
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】张君成, 王忠文, 曾东强, 李界秋, 熊英, 时婷婷
【申请人】广西大学