一株体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌Streptomycessp.OsiSh-2，CGMCCNo.8716，该菌具有体外高效拮抗稻瘟病菌能力，能对至少5种不同生理小种的梨孢霉菌有拮抗作用；能够分泌几丁质酶及纤维素酶；具有较强的生长能力，易于培养。在生物防治水稻稻瘟病、开发新药物等方面具有较大的开发潜力。
【专利说明】一株体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，具体涉及从水稻中分离获得一株具有体外高效拮抗稻瘟 病菌能力的水稻内生放线菌。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的农作物之一。包括大多数发展中国家在内，全世界约40 % 人口的主要食物来自水稻。但是，水稻的高产和稳产会受到一些病害的影响，其中以稻瘟病 尤为严重。该病在全球85个有水稻种植的国家和地区均有发生，每年由于水稻稻瘟病导致 的损失约占总产量的10%?30%。稻癌病由真菌梨孢霉oiTzae)引起，该 病菌能够侵染水稻的大多数组织。传统的稻瘟病控制主要依靠喷洒化学农药和选育新的抗 病品种。由于稻瘟病原菌遗传复杂、致病多样和极易变异等特点，新抗病品种需辛苦培育， 且常在推广数年内失去抗性，这便降低了该方法控制稻瘟病的效果。化学农药是目前抗稻 瘟病的一种有效措施，但是大量和长期使用化学农药，既增加生产成本，也易导致病原菌产 生抗药性而降低防治效果，同时造成环境污染和破坏生态平衡，给人类健康及环境安全带 来严重隐患。因此，越来越多的科学家希望通过生物农药来控制和解决稻瘟病。
[0003] 内生菌是一种能够在植物体内存活而不对寄主植物具有明显危害的微生物，内生 菌制剂可以减少由于田间操作、气候变化等因素对其生长、繁殖和防治效果的影响，是一种 天然的微生物活体农药。以抗稻瘟病菌的内生菌活体作为农药制剂，不仅能以其更安全的 生物代谢物避免化学农药产生的隐患，还可以利用种类丰富的内生菌与病原菌之间的拮抗 对应关系，减少稻瘟病病菌多样、易变异带来的影响。
[0004] 从水稻中可以分离、筛选出一些具有抑制稻瘟病菌的内生菌，这些内生菌或是分 泌某些代谢物、或是提高水稻抵抗力来抵抗稻瘟病菌。目前所分离得到的抗病性内生菌大 多是易培养的细菌和真菌类群，而作为难分离的内生放线菌则报道较少。放线菌又是抗生 素的主要来源，目前已经发现的抗生素有近6000种，其中4000多种由放线菌产生。作为一 类能产生多种有益代谢产物的微生物，放线菌显然具有很高的经济价值。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种具有防治稻瘟病潜力的水稻内生放线菌，该菌能对至少5种不 同生理小种的梨孢霉菌(稻瘟病的致病真菌）有拮抗作用，液体培养在第7天时菌液抑制稻 瘟病的能力最强。该菌株分离自健康水稻鞘部，其具有较强的生长能力，易于培养。 发明所得菌株通过结合菌落菌体形态特征和基于细菌16S rRNA基因序列的系统发 育分析，鉴定为 属，命名为 0siSh-2。该菌株已于 2014 年 1月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)所保藏(保藏地址 是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No. 8716,分类命名为链霉菌 OsiSh-2,经检测存活。 OsiSh-2菌株的分离、纯化和筛选过程为：将籼稻谷梅4号洗去泥土后进行植物表面消 毒，干燥后置于内生菌分离培养基(MS)上，27°C培养，待内生放线菌长出，再结合划线分离 法在固体PDA平板上进行分离，直至获得其纯培养物。将分离得到的菌株与稻瘟病致病菌 梨孢霉同时接种到PDA固体平板上，放入霉菌培养箱中28°C倒置培养，每天观察，筛选拮抗 真菌效果最明显的菌株，即从水稻鞘部分离得到的高效拮抗梨孢霉菌株OsiSh-2。
[0006] 稻瘟病菌的细胞壁主要成分是几丁质和纤维素，用几丁质培养基和纤维素培养基 对该放线菌能否分泌几丁质酶及纤维素酶进行了定性检测。该放线菌在28°C恒温培养条件 下能产生几丁质酶和纤维素酶，表明OsiSh-2可能通过分泌几丁质酶和纤维素酶，溶解杀 死真菌性病害。 本发明所述菌株的有益效果为：菌株作为健康水稻的内生菌，在28°C、PDA培养基培养 条件下能有效抑制稻瘟病病菌的生长；在ISP II液体培养基中，28°C，150r/min液体震荡培 养条件下培养7天后，取出100 μ L菌液，加入到混合有梨孢霉孢子的PDA培养基中培养， 有明显的抑制稻瘟病生长的抑菌圈出现；能对至少5种不同生理小种（来自于湖南农业大 学和湖南亚华种子有限公司）的梨孢霉菌有拮抗作用；本菌株具有较强的生长能力，易于培 养；能够分泌几丁质酶及纤维素酶。该菌的上述特征表明其在生物防治水稻稻瘟病、开发新 药物等方面具有较大的开发潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0007] 图1 :本发明菌株的菌落形态图，a. OsiSh-2培养5天；b. OsiSh-2生长25天后 菌体变为黑色的培养图； 图2 :本发明菌株的显微观察图； 图3 :本发明菌株的进化树； 图4 :本发明菌株液体培养生长情况图； 图5 :本发明菌株在固体培养基上对稻瘟病菌RB3的抑制情况，a. OsiSh-2培养5天； b. OsiSh-2生长25天后菌体变为黑色的培养图； 图6 :本发明菌株培养7天的菌液对稻瘟病菌RB3的抑制情况，a. OsiSh-2培养5天； b. OsiSh-2生长25天后菌体变为黑色的培养图； 图7 :本发明菌株对5种不同生理小种的稻瘟病梨孢霉菌的抑制情况，a. - e.稻瘟病 菌对照；f. - j. 0siSh-2对5种不同生理小种的梨孢霉菌的抑制； 图8 :本发明菌株分泌几丁质酶的定性实验，a. OsiSh-2分泌几丁质酶的定性实验结 果；b.空白对照； 图9 :本发明菌株分泌纤维素酶的定性实验，a. OsiSh-2分泌纤维素酶的定性实验结 果；b.空白对照；
【具体实施方式】： 实施例1 :0siSh-2菌株的分离 OsiSh-2菌株的分离、纯化和筛选过程为：将籼稻谷梅4号洗去泥土后进行植物表面消 毒，干燥后，按照根、茎、叶鞘、叶片四种组织分割，每种组织都切割为lcm左右的小段，置于 内生菌分离培养基(MS)上，27°C培养，待内生放线菌长出，再结合划线分离法在固体PDA平 板上进行分离，直至获得其纯培养物。将分离得到的菌株与稻瘟病致病菌梨孢霉同时接种 到PDA固体平板上，放入霉菌培养箱中28°C倒置培养，每天观察，筛选拮抗真菌效果最明显 的菌株，分离得到来自水稻叶鞘组织的高效拮抗梨孢霉菌株〇siSh-2。用几丁质培养基和纤 维素培养基对该放线菌能否分泌几丁质酶及纤维素酶进行了定性检测。该放线菌在28°C恒 温培养条件下能产生几丁质酶和纤维素酶，表明OsiSh-2可以通过分泌几丁质酶和纤维素 酶，溶解杀死真菌性病害。 所用MS培养基组成为：大豆粉20g，甘露醇20g，琼脂粉20g，蒸馏水定容至1L，调节PH 值范围7. 2±0. 2,121°C高温高压灭菌25分钟。PDA培养基组成为：土豆200g，煮沸30min 后4层纱布过滤，滤液中加入10g葡萄糖，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，自然PH，121°C高温 高压灭菌25分钟。ISP II液体培养基组成为：麦芽浸粉10g，酵母浸粉4g，葡萄糖4g，琼脂 18g，蒸馏水定容至1L，调节PH值范围7. 2±0. 2，121°C高温高压灭菌25分钟。几丁质培养 基组成为：胶状几丁质4. 5g，硫酸铵3g，七水合硫酸镁0. 3g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸一水合 物lg，吐温80 200 μ L，溴甲酚紫0· 15g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，调节PH值到4. 7,121°C 高温高压灭菌15分钟。纤维素培养基：羧甲基纤维素钠20g，磷酸氢二钠2. 5g，磷酸二氢 钾1. 5g，蛋白胨2. 5g，酵母浸粉0. 5g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，调节PH值到7. 0,121°C 高温高压灭菌15分钟。
[0008] 实施例2 :菌株的生物学鉴定 1.菌株形态特征 (1) 菌落形态特征：将单菌落划线接种至PDA固体培养基中，将平板倒置于恒温培养 箱，28°C培养，3天以内长出无色基生菌丝和气生菌丝，菌落表面褶皱、边缘紧致。3天后长 出白色孢子覆盖在菌落上。20天后菌体逐渐变为黑色，见附图1。 (2) 菌体形态特征：用插片法培养该菌，在光学显微镜下观察其气生菌丝分枝情况，见 附图2。 2.菌株16S rRNA分析 研磨菌体并用玻璃砂剧烈震荡后，采用革兰氏阳性菌基因组DNA提取试剂盒 (Shanghai Generay Biotech Co·, Ltd)的方法，抽提菌株基因组DNA，以该DNA为模板，米 用放线菌16S rRNA基因引物（27F-765R及704F-1492R)，扩增出菌株的16S rRNA片段并 测序，将得到的16S rRNA序列与NCBI中的核酸数据库进行Blast同源性比对（www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast)，与数据库中已知放线菌 的 16S rRNA 全长序列的相似性达到了 99%，V4、V5可变区的序列相似性达到100%，将该菌株鉴定为 5^/'<9/7(〇?/^<951属，命名为5^/'(9/7(〇?/^(9>58。.08丨311-2。使用软件]\0^^5.0中的邻近结合法 (neighbor-joining method)制作 0siSh-2 的系统发育树，见附图 3。 实施例3 :菌株在ISP II液体培养基中的生长情况 采用放线菌称干重法绘制生长情况图。将所得菌株接种到装有50mL的ISP II液体培养 基的250mL规格锥形瓶中，在28°C，150r/min条件下振荡培养，每天取样20mL，平行取3次， 4000rpm离心30min以去掉上清液，烘干过夜称取菌体干重。共测量7天，其结果见附图4。
[0009] 实施例4 :菌株对稻瘟病的抑制情况结果 (1)固体拮抗实验：在直径为90mm的培养皿中心接种梨孢霉菌RB3 (来自湖南亚华种 子有限公司），刮取活化好的OsiSh-2菌在距离真菌30mm的位置上划一条线。封口膜封好 培养皿，28°C倒置培养7天以上，最后以生长出来的真菌与放线菌之间的距离远近判断该 菌的拮抗能力强弱，结果见附图5。拮抗其他4种梨孢霉菌生理小种61、62、307、02(来自 于湖南农业大学和湖南亚华种子有限公司）见附图7。 (2)液体拮抗实验：将菌株接种到装有50mL ISP II液体培养基的250mL规格锥形瓶 中，28°C、150r/min条件下震荡培养，每天取出lOOyL菌液，注入置于混合有梨孢霉孢子 的PDA培养基上的牛津杯中，28°C培养7天以上，观察抑制稻瘟病生长的抑菌圈大小，结果 见附图6,可见第7天菌液的抑菌圈所占面积约为梨孢霉培养总面积的78%。
[0010] 实施例5 :分泌几丁质酶及纤维素酶的定性实验 (1)几丁质酶定性实验：用灭菌接种环挑取OsiSh-2菌块置于几丁质培养基中央，于28 °〇恒温培养7天后开始观察培养基颜色变化情况。空白几丁质培养基为黄色，OsiSh-2产 生的几丁质酶使培养基变为紫色，见附图8,表1。
[0011] (2)纤维素酶定性实验：使用刚果红染色法。将OsiSh-2挑取置于纤维素培养基 中央，培养观察7到15天。培养基经刚果红染色后呈红色，当培养基中的羧甲基纤维素被 OsiSh-2所产生的纤维素酶分解后，培养基中出现以OsiSh-2菌为中心的白色透明圈，见附 图9,表1。
[0012] 表1菌OsiSh-2的水解酶产生情况
【权利要求】
1. 一株体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌，所述水稻内生放线菌为 5^/'<9/^〇?/^<9518卩.〇8丨311-2，保藏号为〇6]\0^1^〇.8716。
2. 如权利要求1所述的水稻内生放线菌在防治水稻稻瘟病上的应用。
3. 如权利要求1所述水稻内生放线菌的培养方法，其特征在于：将所述菌株接种到装 ISP II液体培养基中，于28°C，150r/min条件下振荡培养。
【文档编号】C12N1/20GK104195064SQ201410278588
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】朱咏华, 刘选明, 杨晓璐, 廖红东, 袁珊珊, 徐婷, 曾夏东, 王真真 申请人:湖南大学