枯草芽孢杆菌jn005及其在防治水稻稻瘟病中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物防治技术领域，具体地说，涉及一种枯草芽孢杆菌JN005及其在 防治水稻稻瘟病中的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻（Oryza sativa)是最重要的粮食作物之一，全球有半数以上人口以水稻为 食。稻瘟病（病菌为Magnaporthe oryzae，其无性世代为Pyicularia oryzae)是水稻最 严重要的真菌性病害之一。稻瘟病菌（Eoryzae)是一种半活体寄生，在感染最初阶段具 有很明显的活体营养阶段。稻瘟病根据其发病部位和发病时期不同可以分为苗瘟、叶瘟、 节瘟、穗瘟、谷粒瘟、枝梗瘟等。目前生产上主要利用抗病品种和使用化学杀菌剂控制稻瘟 病。主要使用的杀菌剂有三环唑、稻瘟灵、咪鲜胺、稻瘟酰胺、异稻瘟净、稻瘟净、敌瘟磷（克 瘟散）、丙环唑、嘧菌酯、戊唑醇、烯丙苯噻唑、氯溴异氰尿酸、三氯异氰尿酸、四氯苯酞、肟 菌·戊唑醇（拿敌稳）、硫磺·三环唑、甲硫?三环唑（稻津）、异稻?稻瘟灵、丙环唑?咪 酰胺等；生物产品化学有效成分或活体微生物如春雷霉素、乙蒜素、氨基寡糖素、枯草芽孢 杆菌、解淀粉芽孢杆菌等。由于稻瘟病菌的遗传背景复杂，易变异，加上抗瘟品种单一化，主 栽品种的遗传同质性高，抗病品种难保持持久抗稻瘟病，常常导致一个新的抗瘟品种在大 面积种植几年后丧失抗性，而感病化。在抗病品种不能满足生产需要的情况下，化学防治是 防治稻瘟病的有效手段，但由于用药不合理，给生态安全带来潜在的不利影响，也值得人们 关注。
[0003] 生物防治即利用有益微生物活体或代谢产物杀灭或者降低病原微生物的数量以 控制植物病害发生和危害。从植物病害的可持续控制来考虑，生物防治是一类绿色安全有 效的防治措施。
[0004] 然而，生物防治领域中常会遇到拮抗微生物在田间自然条件下定殖力差、对病害 防治效果不稳定等问题。大量的研宄也表明，室内筛选出的拮抗微生物在温室中对病原菌 有较强的抑制作用，而在大田防治中效果不理想，这可能是由于一方面菌株不适应大田生 态环境而不能很好的定殖到植物的根围，另一方面与大田土壤中复杂的微生物种类与拮抗 菌株之间出现相互作用，导致拮抗微生物防效降低，因此，选择筛选生物菌株的田间适应能 力强或高效代谢产物应用于大田病害防治是解决上述问题的重要途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株新分离的生防菌-枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) JN005〇
[0006] 本发明的另一目的是提供所述枯草芽孢杆菌JN005在防治水稻稻瘟病中的应用。 [0007] 为了实现本发明目的，本发明的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) JN005是从湖 南省桃江县大栗港镇牌形上村（N28° 31' 49. 02"，Ε11Γ 54' 24. 86")感稻瘟病水稻 品种湘早籼24号的病丛中选取健康稻株分离获得的，采用与稻瘟病菌平板对峙法筛选出 的对稻瘟病菌菌丝抑制率达84%的拮抗菌株，现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址： 中国武汉，武汉大学，邮编430072,保藏编号CCTCC NO !M2015228,保藏日期2015年4月14 曰。
[0008] 菌株JN005在NA培养基平板上培养，对其菌落形态进行观察及对其菌体的扫描电 镜图观察，菌落形态不规则，边缘隆起，中间凹陷，粗糙不透明，表面干燥，污白色或微黄色。 JN005菌体呈杆状，鞭毛周生，无荚膜，大小为（0. 7~0. 8) μ mX (2~3) μ m，芽孢椭圆倒柱 状位于菌体中央或稍偏，长0. 5~I. 0 μ m，形态如图1所示。
[0009] 菌株JN005能使淀粉水解、明胶液化，能利用D-果糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、D-甘露 醇，但不能产生H2S,吲哚试验反应为阴性，不能分解酪蛋白（不产生酪蛋白酶），不能利用 D-阿拉伯糖。
[0010] 菌株 JN005 的 16S rDNA 序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0011] 本发明还提供由所述枯草芽孢杆菌JN005制备的菌剂。
[0012] 本发明还提供所述枯草芽孢杆菌JN005或由其制备的菌剂在防治水稻稻瘟病中 的应用。
[0013] 前述的应用包括将所述枯草芽孢杆菌JN005或由其制备的菌剂施用于水稻作物。 其中，所述菌剂中枯草芽孢杆菌JN005的活菌浓度彡5. 5X 106cfu/mL。
[0014] 本发明进一步提供一种防治水稻稻瘟病的方法，其包括将所述枯草芽孢杆菌 JN005的培养液进行离心，所得上清液施用于水稻作物，或将枯草芽孢杆菌JN005的活体菌 配制菌悬液施用于水稻作物。
[0015] 例如，菌株JN005在NA固体培养基（蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L， 琼脂17g/L，pH 7. 0,蒸馏水配制）平板上活化后，用打孔器打取直径5mm的2个菌饼接入 装有150mL NB液体培养基（蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，pH 7. 0,蒸馏水配 制）的250mL三角瓶中，28°C、180r/min条件下，摇床振荡培养6d，用细菌过滤器过滤，获得 枯草芽孢杆菌JN005代谢产物。
[0016] 菌株JN005代谢产物在稻瘟病菌感染前和感染后，以及活体菌（浓度 多5. 5X 106cfu/mL)在稻瘟病菌感染前3-5d，采用喷雾防治法均有较好的防效，表明该菌株 具有良好的保护和治疗效果。
[0017] 此外，采用平板对峙培养法发现菌株JN005对多种病原指示菌，例如禾谷镰 刀菌（Fusarium graminearum)、稻曲病菌（Ustiloginoidea virens)、辣椒炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporioides)生长的抑菌率分别为 70. 1 %、73· 6%和 62. 5%。
[0018] 利用本发明提供的枯草芽孢杆菌JN005对水稻稻瘟病进行防治，避免了化学防治 对环境和稻米安全的潜在不良影响及抗病品种利用的感病化风险。菌株JN005活体菌及其 代谢产物对稻瘟病均有较好的防效，保护和治疗作用兼具，可将其作为活体菌剂和代谢产 物的剂型加工开发。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明枯草芽孢杆菌JN005的菌株扫描电镜下菌体形态。
[0020] 图2为本发明实施例1中枯草芽孢杆菌JN005在NA平板上培养结果；其中，A为 菌落形态，B为划线培养结果。
[0021] 图3为本发明实施例1中枯草芽孢杆菌JN005对不同病原指示菌的生长抑制效 果；其中，Al为稻曲病菌（Ustiloginoidea virens) ;A2为JN005对稻曲病菌菌丝生长抑 制效果；Bl为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum) ;B2为JN005对镰刀菌菌丝生长抑制效 果。
[0022] 图4为本发明实施例2中枯草芽孢杆菌JN005及其代谢产物对稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)的菌丝生长抑制效果；其中，A为菌株JN005对稻瘟病菌生长抑制效