芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZY菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一种芽孢杆菌（AaciBw1S 5/7. ) ZY菌株，还涉及 上述的菌株在抑制冬枣轮纹病的应用。
【背景技术】
[0002] 冬枣口感鲜嫩多汁，风味酸甜适口，是鲜食品种中的佼佼者，自推广种植以来给广 大种植户带来了巨大的经济利益，但是随着栽培面积的迅速增加，冬枣病害的发生愈来愈 重，其中冬枣轮纹病是较为常见和危害严重的真菌病害，冬枣轮纹病不仅直接造成冬枣产 量下降与品质降低，而且病原真菌可分泌产生对人畜有害的毒素与代谢物，对人们的健康 构成极大威胁。冬枣轮纹病的防治主要是通过喷洒化学药物来防治，但长期不合理使用化 学农药产生了诸多问题。如：化学农药的高毒、高残留对人、畜的健康造成了危害，对土壤、 水体、大气造成了严重污染，破坏了生态平衡；病原菌药性的不断增强，农药的使用量和使 用频度不断加大，出现了用药量与病害相互递增的恶性循环。因此开发对人类和环境友好、 并具良好防治效果的、新的植物病害防治办法迫在眉睫。
[0003] 随着人们对食品安全的日益重视，可持续控制病虫害发展的需要，生物防治受到 各国政府和植物保护专家的重视。生物防治以生态学为基础来控制有害生物，是综合防治 体系中一个必不可缺少的组成部分。它避免了化学农药使用带来的一系列植保、环境和能 源方面的问题，避免了农药残留对人畜的危害。应用生物农药取代化学农药已逐渐成为一 种趋势。
[0004] 芽孢杆菌种群庞大，繁殖能力强，耐热、耐酸碱、理化性质稳定，抑菌谱广泛，在 植物病害生物防治中占有重要地位，是主要的生防菌种，包括枯草芽孢杆菌 、赌状芽抱杆菌（ifeciBws Cerew1S)、地衣芽抱杆菌（ifeciBws 、 巨大芽抱杆菌576?? 、解淀粉芽抱杆菌、 多粘芽孢杆菌和短小芽孢杆菌等。国内外对芽 孢杆菌的研发已投入生产实践，做成商品制剂，取得了高效的生防效果，实验了作物增产。
[0005] 然而，随着生防菌研宄的广泛开展，新菌发现越来越难。贝壳堤是由生活在潮间带 的贝类死亡之后的壳体及碎肩，经波浪搬运，在高潮线附近堆积而成的。黄河三角洲滨州市 无棣、沾化海岸近五六千年以来成陆过程中形成的贝壳堤，生态环境独特，与美国易斯安娜 州和南美苏里南的贝壳堤并称为世界三大古贝壳堤，而且是世界上规模最大、惟一的新老 并存的贝壳堤。贝壳堤独特的生态环境赋予了该地区特有的生物资源，为发掘新的生防细 菌和开发生物农药提供了良好的资源。加快生物农药的研发和应用，符合我国农业发展的 需要，对于保障人们的饮食健康具有重要意义，发展前景广阔。
【发明内容】
[0006] 针对冬枣轮纹病日益严重的问题，本发明提供一种芽孢杆菌沙.）ZY， 该菌株在冬枣轮纹病防治中的应用中起到了良好的作用。
[0007] 本发明提供的芽孢杆菌5Τ7.)ΖΥ菌株，于2013年4月19日保藏于"中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号 院3号。保藏编号为CGMCC No. 7490。
[0008] 上述的芽孢杆菌沙.）ZY菌株，其16S rDNA的核苷酸序列如序列表所 不O
[0009] 上述的芽孢杆菌5/Λ )ZY菌株在抑制冬枣轮纹病的应用，也是本发明所 要保护的范围。施用后对冬枣轮纹病的生防效果可达75. 6%。具体过程为：以LB培养基进 行发酵一将发酵液对试验田进行喷洒一对防治效果进行测定。
[0010] 芽孢杆菌（5/7. ) ZY菌株的筛选 将从贝沙堤岛滩涂采集的土样称取3g，在无菌条件下研碎，放入盛有无菌生理盐水的 锥形瓶中，加入一定量的玻璃珠后，在37°C恒温摇床中进行振荡48h，使土壤与水充分混 匀。将土壤悬液进行梯度稀释，取100 μ 1不同稀释度的土壤溶液分别在佐贝尔培养基和LB 培养基上涂布，每个浓度溶液做一次重复，37°C培养24h后取出平板，观察各平板上的菌 落数并记录。在无菌条件下，挑取各不同单菌落在新的平板上划线分纯，直至平板上菌落纯 化。将形态特征不同的各单菌落分别与冬枣轮纹病菌做初步拮抗实验，观察各菌落抑菌效 果并做好记录，最终获得抑菌效果最好的sp. ZY。
[0011] 芽孢杆菌5/7. ) ZY菌株菌落特征：在LB培养基平板上菌落较大、圆形、 隆起、不透明；幼龄菌表面光滑，边缘整齐、产黏液，培养48h以上菌落表面呈现白色褶皱。
[0012] 芽孢杆菌5/7. ) ZY菌株的细胞形态特征：革兰氏阳性菌，短杆状，有芽 孢，中生或端生。
[0013] 芽孢杆菌取）ZY菌株的生理生化特征：生长温度4~55°C，NaCl耐受 范围是〇~7% ;能利用麦芽糖、乳糖、山梨醇和果糖，不利用L-天冬氨酸、肌酸；接触酶实验、 V-P实验、西蒙氏实验、淀粉水解试验、明胶液化实验均为阳性，甲基红实验、纤维素水解实 验、酯酶实验、葡萄糖氧化发酵实验为阴性。
[0014] 该菌发酵液产生活性物质，发酵LB培养基组成为g/L :酵母浸出膏5g ;蛋白胨 IOg ;NaCl IOg ;蒸馏水 1000 mL ;pH 7. 0-7. 2。
[0015] 芽孢杆菌UaciBw1S 577. ) ZY菌株的16S rDNA基因序列特征：CGMCC No. 7490接 种于LB培养基，120 rpm，37°C震荡培养16h，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶和SDS破壁， 采用酚-氯仿法提取基因组DNA，用正相引物27F (5' -GAGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3'），和反 向引物1541R(5'-AAGGAGGTGATC CAGCC-3'），对其16S rDNA基因进行PCR扩增，将扩增的产 物由北京三博公司进行测序。PCR条件为：94°C，10min ;94°C，45s ;55°C，45s ;72°C，90s ; 30个循环；72°C 10min，4°C保存。16S rDNA基因序列长度为1452bp，测序结果与NCBI数据 挥对Y1C, 实与 Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus methylotrophicus, Bacillus 的同源性较高，其中，其同源性最高的是同源性达 99%，其16S rDNA的序列如序列表1所示。
[0016] 参照《Bergey s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol. VID的内容，根据其 形态特征和生理生化特征，以及16S rDNA基因序列结果，经多相分类鉴定ZY为一新菌，属 于芽抱杆菌属（AaciBw1S 5/7. ZY )。
[0017] 5/Λ )ZY菌株可以在营养培养基，如：普通牛肉汁、LB、营养琼脂中生长， 也可以在佐贝尔（Zobell) 2216E培养基、PDA培养基或添加葡萄糖或蔗糖的无机盐培养基 中生长。
[0018] 本发明的有益效果在于，本发明提供的5/7. )ZY菌株，是一种优良的生 防芽孢杆菌，该菌株以及其液体发酵液均能够产生对冬枣轮纹病菌有抑制作用的活性代谢 产物，对冬枣轮纹病的生防效果达75. 6%以上，具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0019] 图1是芽孢杆菌（5/7. ) ZY菌落形态图； 图2是芽孢杆菌5/7. ) ZY对冬枣轮纹病菌生长的影响图； 图3是芽孢杆菌5/7. ) ZY菌株发酵液对冬枣轮纹病菌生长的影响图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图和【具体实施方式】来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技 术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。
[0021] 实施例1 本发明提供的芽孢杆菌5/7. ) ZY菌株的分离筛选。