>[0022] 将从贝沙堤岛滩涂采集的土样称取3g，在无菌条件下研碎，放入盛有无菌生理盐 水的锥形瓶中，加入一定量的玻璃珠后，在37°C恒温摇床中进行振荡48h，使土壤与水充 分混匀。将土壤悬液进行梯度稀释，取100 μ 1不同稀释度的土壤溶液分别在佐贝尔培养 基（蛋白胨5g ;NaCl 19. 45g ;梓檬酸铁0· Ig ;酵母膏1.0 g ;溴化钾0· 08g ;娃酸钠0· 004g ; NH4NO3 0. 0016g ；Na2S04 3 . 24g ；NaHC03 0. 16g ；Na2HP04 0 . 008g ；CaCl2 I. 8g ；MgCl2 8. 8g ； KCl 0· 55g ;氟化钠 0· 0024g ;氯化锶 0· 034g ;琼脂 15. Og ;蒸馏水 1000ml ;pH 7. 4-7. 8)和 LB培养基(酵母浸出膏5g ;蛋白胨IOg ;NaCl IOg ;蒸馏水1000 mL ;pH 7. 0-7. 2)上涂布，每 个浓度溶液做一次重复，37°C培养24h后取出平板，观察各平板上的菌落数并记录。在无 菌条件下，挑取各不同单菌落在新的平板上划线分纯，直至平板上菌落纯化。将形态特征不 同的各单菌落分别与丝状真菌(冬枣轮纹病和棉花枯黄萎病）做初步拮抗实验，观察各菌落 抑菌效果并做好记录，最终获得抑菌效果最好的Bacillus sp. ZY，结果如图1所示。
[0023] 实施例2 : 本发明提供的芽孢杆菌5/7. ) ZY菌株的形态特征和生理生化特征。
[0024] 参照《Bergey' s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol. VID的试验方法进 行，检测其革兰氏染色，菌落大小和形态，生长温度NaCl耐受性，淀粉水解、纤维素水解、明 胶液化，以及碳源利用情况。
[0025] 结果表明，该菌为革兰氏阳性菌，短杆状，产芽孢，中生或端生。在LB培养基平板 上菌落较大、圆形、隆起、不透明；幼龄菌表面光滑、边缘整齐、产黏液，培养48h以上菌落呈 白色褶皱(见图2)。生长温度4°C ~55°C，NaCl耐受范围是0%~7%。能利用麦芽糖、乳糖、山 梨醇和果糖，不利用L-天冬氨酸、肌酸；接触酶实验、V-P实验、西蒙氏实验、淀粉水解试验、 明胶液化实验均为阳性，甲基红实验、纤维素水解实验、酯酶实验、葡萄糖氧化发酵实验为 阴性。
[0026] 实施例3 : 本发明提供的芽孢杆菌5/7.)ΖΥ菌株的16S rDNA基因的PCR扩增和序列测 定。将该菌株接种于LB培养基，120rpm，37°C震荡培养16h，离心收集菌体，悬浮后加入溶 菌酶和SDS破壁，采用酚-氯仿法提取基因组DNA，用正相引物27F (5' -GAGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3'），和反向引物 1541R(5' -AAGG AGGTGATCCAGCC-3'），对其 16S rDNA 基因进 行PCR扩增，将扩增的产物由北京三博公司进行测序。PCR条件为：94°C，IOmin ;94°C， 45s;55°C，45s;72°C，90s;30 个循环；72°C 10min，4°C保存。16S rDNA 基因序列长度为 1452bp，测序结果与 NCBI 数据库对比，发现其与 Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus methylotrophicus，Bacillus subtilis的同源性较高，其中，其同源性最高的是Bacillus methylotrophicus，同源性达99%，其16S rDNA的序列如序列表1所示。
[0027] 实施例4 : 本发明提供的芽孢杆菌5/7. ) ZY菌株的发酵培养 发酵培养基即为LB液体培养基。用接种环从LB平板挑取ZY菌单菌落，接种到含有 LB液体培养基的试管中，37°C恒温摇床培养18h获得种子液，按照5%接种量接种到含有 400mlLB培养基的IL三角瓶中，37°C 200rpm，培养3. 5d得到发酵液。
[0028] 实施例5 : 本发明提供的芽孢杆菌5/7. ) ZY菌株发酵液对冬枣轮纹病菌的抑制作用 将实施例4中的发酵产物经10 000 rpm离心20min，将上清液用灭菌的0. 22 μ m的微 孔滤膜过滤，得到发酵液上清。先用打孔器在活化好的冬枣轮纹病真菌平板上打孔，将菌饼 转移至PDA平板中央，培养48h，再将灭菌后的牛津杯放置于平板相应位置，吸取200 μ 1发 酵液上清缓缓地加入到牛津杯中，整个过程应防止牛津杯内液体渗漏。最后，将对峙平板置 于28°C恒温培养箱中，培养12h，结果如附图3所示。从图中可以看出ZY的发酵液上清对 冬枣轮纹病菌的生长具有明显抑制作用。
[0029] 实施例6 本发明提供的芽孢杆菌5/7. ) ZY菌株在冬枣试验田4号田中的应用。
[0030] 通过发酵液能够防治冬枣轮纹病，具体过程为：对5/7.)进行发酵(发酵 条件同实施例4)，发酵液稀释50倍喷雾，在枣树落花后第1次喷雾施药，以后间隔15~20d 施药1次，共4次，整个生育期施药5次，其生防效果可达75. 6%。
【主权项】
1. 一种芽孢杆菌（W1S 5/7. )ZY菌株，于2013年4月19日保藏于"中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心"，保藏编号为CGMCC No. 7490。2. 如权利要求1所述的芽孢杆菌（沙.）ZY菌株，其16S rDNA的核苷酸序列 如序列表所示。3. 如权利要求2所述的芽孢杆菌（5/7. )ZY菌株，该菌株为革兰氏阳性菌，短 杆状，产芽孢，中生或端生；在LB培养基平板上菌落较大、圆形、隆起、不透明。4. 如权利要求3所述的芽孢杆菌（5/7. )ZY菌株，该菌株的幼龄菌表面光滑、 边缘整齐、产黏液，培养48h以上菌落呈白色褶皱。5. 如权利要求4所述的芽孢杆菌（及沙.）ZY菌株，该菌株的生长温度4~55°C， NaCl耐受范围是0~7%。6. 如权利要求5所述的芽孢杆菌沙.）ZY菌株，该菌株能利用麦芽糖、乳糖、 山梨醇和果糖，不利用L-天冬氨酸、肌酸。7. 如权利要求6所述的芽孢杆菌（5/7. ) ZY菌株，该菌株接触酶实验、V-P实 验、西蒙氏实验、淀粉水解试验、明胶液化实验均为阳性，甲基红实验、纤维素水解实验、酯 酶实验、葡萄糖氧化发酵实验为阴性。8. 如权利要求7所述的芽孢杆菌（5/7. ) ZY菌株的应用，其特征在于，该菌发 酵液产生活性物质，发酵LB培养基组成为g/L :酵母浸出膏5g ;蛋白胨IOg ;NaCl IOg ;蒸馏 水 10OOmT,;。9. 如权利要求8所述的芽孢杆菌（5/7. ) ZY菌株在抑制冬枣轮纹病的应用。
【专利摘要】本发明属于微生物领域，具体涉及一种芽孢杆菌（Bacillus sp.）ZY菌株，还涉及上述的菌株在抑制冬枣轮纹病的应用。本发明的芽孢杆菌（Bacillus sp.）ZY菌株，于2013年4月19日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心” ，保藏编号为CGMCC No.7490。本发明的有益效果在于，本发明提供的（Bacillus sp.）ZY菌株，是一种优良的生防芽孢杆菌，该菌株以及其液体发酵液均能够产生对冬枣轮纹病菌有抑制作用的活性代谢产物，对冬枣轮纹病的生防效果达75.6%以上，具有很好的应用前景。CGMCC No.749020130419
【IPC分类】A01N63/02, C12N1/20, A01P3/00, C12R1/07
【公开号】CN104974957
【申请号】CN201510364150
【发明人】王君, 范延辉, 姚志刚, 石东里
【申请人】滨州学院
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年6月26日