萎缩芽孢杆菌5-2a及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于利用微生物及其代谢产物提高原油采收率的三次采油技术领域，具体 涉及萎缩芽孢杆菌5-2a及其应用。
【背景技术】
[0002] 石油是不可再生资源，愈采愈少。在世界范围内，经过一次和二次采油后，地层中 仍残留60 %~70 %的原油无法采出；有许多油田已进入开采中后期，枯竭矿比例逐年增加； 还有相当数量的稠油矿的采出率很低;低渗、深层、高温高压高含水及小断块油层等不宜用 热驱与化学驱等传统方法开采。如何提高上述低产油层的采油率，充分利用各种难采油藏 资源，是目前亟待解决的问题。
[0003] 利用微生物技术提高原油采油率被认为是目前最有发展前景的采油技术，对于高 含水的枯竭油藏开采具有更为重要的意义。微生物采油技术是包括微生物生长、运移及新 陈代谢等复杂过程在内的生物学和物理化学综合技术，具有多重作用及综合效果，但又具 有较强的选择性和针对性。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株萎缩芽孢杆菌5_2a及其 应用，该细菌具有很强的降解与产表面活性物质功能，同时产酸、产气，可降低原油粘度，并 使附着介质上的原油脱落，具备提高原油流动性及原油采收率多种功能。
[0005] 为了达到以上目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
[0006] (一）萎缩芽孢杆菌5-2a，分离自安塞油田的原油及油污土壤中，于2014年12月28 日保藏于武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC Μ 2014673,命名为萎 缩芽抱杆菌5-2a(Bacillus atrophaeus 5_2a)〇
[0007] 通过PCR反应，从芽孢杆菌5-2a的16S rDNA中扩增得到1.6kb的基因片段，将PCR 产物纯化后，由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。通过与Genebank中其他菌株16S rDNA序列进行对比分析，该芽抱杆菌与Bacillus atrophaeus AB021181的16S rDNA序列同 源性达到99.86 %，因此确认该芽孢杆菌5_2a为萎缩芽孢杆菌(Baci 1 lus atrophaeus)。
[0008] 将萎缩芽孢杆菌5-2a在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，该菌株菌落直径较小，白色， 圆形，菌落干燥，不透明，边缘不整齐，菌落表面褶皱，无光泽，电镜下细胞呈长杆状，宽0.5 ~Ι.Ομπι，长2.0~4.Ομπι。革兰氏染色阳性，需氧，葡萄糖与蔗糖发酵为阳性，柠檬酸与丙二 酸利用为阳性，乙醇氧化呈阴性，甲基红试验和V-P试验均为阳性，硝酸盐还原试验与脲酶 试验均为阳性，产氨气，反硝化试验为阴性，能水解淀粉与明胶。
[0009] (二)萎缩芽孢杆菌5-2a能产表面活性物质。
[0010] 进一步地，所述表面活性物质为脂肽类表面活性物质。
[0011] 进一步地，所述萎缩芽孢杆菌5_2a能以尿素为氮源合成脂肽类表面活性物质。
[0012] (三)萎缩芽孢杆菌5-2a在原油降解中的应用。
[0013] (四）萎缩芽孢杆菌5-2a在固体石蜡降解中的应用。
[0014] 利用微生物技术提高原油采油率的机理十分复杂，大致分为两个方面:一是微生 物细胞对油层的直接作用，如菌体对油藏大孔道的选择性封堵作用及其对原油的降解作 用，二是微生物代谢产物如表面活性物质、生物气、酸及有机溶剂等对油层的间接作用。
[0015] 生物表面活性物质是微生物在一定条件下代谢合成的具有一定表面活性和界面 活性，同时含有亲水基和疏水基的两性化合物，主要包括糖脂类、脂肽类、磷脂类以及结合 多糖等，其类型与菌株及底物有关。生物表面活性物质除具有化学合成表面活性剂所具有 的降低表面张力、稳定乳化液以及分散、增溶与润湿等性能外，同时具有资源易得、能耗小、 生态安全等优点。因此，目前已有将产表面活性物质的芽孢杆菌用于提高原油采收率，但所 筛选菌株多为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌等，且所选菌株或以产表面活 性物质为主，或以降解原油中的高分子物质为主，不同时具备有效降解与有效产表面活性 物质等多种功能，并且尚无有关萎缩芽孢杆菌在驱油方面的报道。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0017] (1)本发明的萎缩芽孢杆菌5_2a能以尿素为氮源合成脂肽类表面活性物质；该表 面活性物质具有良好的排油活性、乳化活性及较低的表面张力值;能够耐受高温、高盐、pH 等极端环境;对滤纸及细沙上附着的原油均具有良好的脱附作用。
[0018] (2)本发明的萎缩芽孢杆菌5-2a对原油及固体石蜡具有降解能力强，降黏幅度大 及产气产酸能力强的特点，作用效果显著。
[0019] 以上萎缩芽孢杆菌5-2a所具有的强降解功能、产气功能、产酸功能及其产表面活 性物质功能在申请日前的文献中均无报道，故该细菌是一株新的多功能驱油细菌。该细菌 对原油中芳香烃、胶质及沥青质的降解率分别为37.8 %、22.0 %及53.1 % ;在30 °C、40 °C时， 使原油粘度较对照原油粘度分别降低24.7%、25.6%;对细沙、滤纸上附着的原油脱附率分 别为90.0%、93.1 % ;防蜡率达98.1 %，清蜡率达89.3% ;使固态石蜡的结晶率较对照降低 88.9% ;在原油中的产气量为发酵液体积的2倍;在原油及固态石錯培养体系中的产酸量分 别达到1.41g/L及1.37g/L，故该细菌对提高原油采收率，对含蜡原油生产及管道运输结蜡 难题解决均具有重要的应用价值。
【附图说明】
[0020] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
[0021] 图1为萎缩芽孢杆菌5-2a的菌落形态及细胞显微形态图。
[0022]图2为萎缩芽孢杆菌5_2a的系统进化树示意图。
[0023]图3为萎缩芽孢杆菌5_2a产生的生物表面活性物质的红外光谱图。
[0024]图4为不同温度、pH及盐浓度处理测试菌株发酵液的排油圈直径、乳化指数及表面 张力的对比图。其中，图4_(a)为不同温度处理测试菌株发酵液的排油圈直径、乳化指数及 表面张力，图4-(b)为不同pH处理测试菌株发酵液的排油圈直径、乳化指数及表面张力，图 4_(c)为不同盐浓度处理测试菌株发酵液的排油圈直径、乳化指数及表面张力。
[0025]图5为萎缩芽孢杆菌5_2a处理固体石蜡在正己烷中的溶解效果对比图；其中，图左 为空白组对固体石蜡溶解性效果，图右为萎缩芽孢杆菌5_2a对固体石蜡溶解性的效果。 [0026]图6为萎缩芽孢杆菌5_2a发酵液对滤纸、细沙吸附原油的脱附效果对比图；其中， 图6_(a)为对滤纸吸附原油的脱附效果对比图，图左为空白组对滤纸的脱附效果，图右为萎 缩芽孢杆菌5_2a发酵液对滤纸的脱附效果；图6_(b)为对细沙吸附原油的脱附效果对比图， 图左为空白组对细沙的脱附效果，图右为萎缩芽孢杆菌5_2a发酵液对细沙的脱附效果。
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但是以下实施例并不作为限制 本发明的保护范围。
[0028] 实施例1菌种的筛选
[0029]利用富集培养和稀释平板法从安塞油田、志丹油田的原油及油污土壤中分离筛选 出数株原油与石蜡降解菌，通过排油圈及表面张力测定法进一步筛选出高产表面活性物质 菌株。
[0030] 实施例2菌种的鉴定
[0031] (1)形态特征
[0032]将萎缩芽孢杆菌5_2a在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，该菌株菌落直径较小，白色， 圆形，菌落干燥，不透明，边缘不整齐，菌落表面褶皱，无光泽，电镜下细胞呈长杆状，宽0.5 ~Ι.ΟμL?，长2.0~4.0μπι。具体形态如图1。
[0033] (2)生化特性
[0034] 革兰氏染色阳性，需氧，葡萄糖与蔗糖发酵为阳性，柠檬酸与丙二酸利用为阳性， 乙醇氧化呈阴性，甲基红试验和V-P试验均为阳性，硝酸盐还原试验与脲酶试验均为阳性， 产氨气，反硝化试验为阴性，能水解淀粉与明胶。
[0035] (3)1防rDNA序列分析
[0036] 通过PCR反应，从芽孢杆菌5-2a的16S rDNA中扩增得到1.6kb的基因片段，将PCR产 物纯化后，由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。通过与Genebank中其他菌株16S rDNA序列进行对比分析，该芽抱杆菌与Bacillus atrophaeus AB021181的16S rDNA序列同 源性达到99.86%，因此确认该芽孢杆菌5_2a为萎缩芽孢杆菌(Baci 1 lus atrophaeus)。萎 缩芽孢杆菌5_2a的系统进化树如图2。
[0037]实施例3菌种产表面活性物质 [0038] (1)菌种产表面活性物质的鉴定
[0039] 鉴定方法:先采用酸化法沉淀表面活性物质，再用薄层层析法进行定性分析，通过 傅里叶红外光谱分析对其官能团做进一步鉴定。具体包括以下步骤：
[0040] ①萎缩芽孢杆菌5_2a发酵液的制备方法为：将萎缩芽孢杆菌斜面接入到装有 100mL液体发酵培养基的600mL组培瓶中，120r/min，30 °C摇床培养3d，萎缩芽孢杆菌5-2a发 酵液。其中，液体发酵培养基的成分为:MgS〇4 · 7Η20 0.3，ΚΗ2Ρ〇45.0，Κ2ΗΡ〇4 · 3H20 10.0， NaCl 5.0,尿素3.0,食用红糖 10.0,自来水 1000mL，pH 7.0。
[0041] ②酸化法沉淀表面活性物质：取萎缩芽孢杆菌5-2a发酵液上清液10ml，6mol/L HC1调pH值至2.0~3.0左右，放入冰箱中4°C过夜，观察是否有白色沉淀产生。若出现白色 沉淀则表明发酵液中含有细菌代谢形成的脂肽类表面活性成分;若无白色沉淀产生，则表 明发酵液中含有细菌代谢形成的糖脂类表面活性成分。离心有白色沉淀的发酵液，8000r/ min离心10min，收集离心所得沉淀，lmol/L盐酸洗涤2次，即得表面活性物质粗品，40°C烘 干。
[0042]③薄层层析:称表面活性物质粗品5mg，6mol/L HC1 110°C下水解24h，进行薄层层 析。显色方法：层析结束后用吹风机将薄板吹干，喷上显色剂后放入ll〇°C烘箱中保温 lOmin。糖脂显色剂为苯酚-硫酸试剂，与糖脂作用显棕色斑点；脂肽显色剂为茚三酮显色 剂，与脂肽作用显红色。
[0043] ④官能团鉴定:傅里叶红外光谱分析，用BRUKER公司生产的Tensor 27型红外光谱 仪进行。采用KBr压片法，扫描范围^Ο-^ΟΟαιΓ1。
[0044]鉴定结果:经薄层层析及红外光谱验证，菌株5_2a产生的表面活性物质为脂肽类 物质，其红外光谱谱图如图3所示。
[0045] (2)表面活性物质稳定性影响因素：
[0046]试验方法:发酵培养结束后，将发酵液8000r/min离心10min除去菌体，收集上清液 并按以下程序处理，处理结束后测定发酵液在20°C时的排油圈直径、乳化指数及表面张力。 [0047] a)温度稳定性:取 20mL 上清液，分别置 20、30、40、50、60、80、100和120°(：下611。
[0048] b)pH稳定性：取20mL上清液，用lmol/L NaOH和HC1 分别调pH至2·0、3·0、4·0、5·0、 6 ·0、7·0、8· 0、9.