专利名称：一种萎缩芽孢杆菌及其制剂和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水产应用微生物技术领域，特别涉及一种萎缩芽孢杆菌以及利用该萎缩芽孢杆菌生产微生物制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
肠道益生菌是一种大多来源于消化道又作用于消化道的活菌制剂，能有效补充动物消化道内的有益微生物，抑制病原菌的生长，改善消化道菌群平衡，提高水产动物的免疫机能或者生长速度。刺参(Apostichopus japonicus Liao，又称仿刺参)，属无脊椎动物，棘皮动物门， 海参纲，仿刺参属。因其营养价值高，养殖规模不断扩大，目前已经发展成为我国沿海最大的海水养殖品种之一。近年来由于刺参高密度养殖和不规范运作以及病害防治技术的相对滞后，病害问题日趋突出，尤其养殖刺参“腐皮综合征”的暴发，造成了严重的经济损失，制约了该产业的健康持续发展。由于刺参特殊的生活习性和养殖特点，且抗生素药物等疾病预防措施本身又存在一些缺点和局限性，故采用微生态制剂将成为防止刺参养殖疾病发生的有效措施之一。芽孢杆菌是目前最常用的益生菌种类。本发明根据来源于自然，回归自然的原则， 从海参肠道筛选出具有拮抗刺参病原菌和高产酶活性的一株萎缩芽孢杆菌，并开发成微生态制剂，有效避免不同来源益生菌菌株之间的差异，保证微生态制剂的安全性和高效性，对海参健康养殖有现实意义。根据来源于自然，回归自然的原则，筛选与原宿主、原生境、原微生态区系、原微生物种群相适应的菌种是开发微生态制剂的最好途径。面对目前海参专用微生态制剂匮乏的局面，从海参肠道筛选益生菌并开发成微生态制剂，避免了不同菌株之间的差异，保证微生态制剂的安全性和高效性。因此，从海参肠道中分离土著益生菌，通过对相关菌株的配伍达到抗菌、免疫、促生长的多重效果，对海参健康养殖有现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供适应于海参肠道的萎缩芽孢杆菌菌株，并给出以该菌株制备微生物制剂的生产方法和该制剂在海参养殖中的使用方法。本发明微生物制剂作为饲料添加剂，能提高海参特定生长率、降低海参死亡率、增强海参的免疫能力和肠道的消化酶活力，同时提高海参的抗病力，达到了抗菌、免疫、促生长多重效果，可减少和取代抗生素的使用，对提高养殖成活率和产品质量，保障该产业的稳产、高产具有十分重要的意义。为解决上述技术问题，本发明提供了一种萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA_12，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010316。为解决上述技术问题，本发明还提供了一种饲料添加剂，包括萎缩芽孢杆菌菌株 Aj080319IA-12，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC M 2010316。所述饲料添加剂的制备方法可以包括以下步骤A.平板培养复壮将低温保存的萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12接种于TSB固体平板培养基上，于20 35°C培养12 36h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于20 35°C培养12 36h ；B.种子液的制备将步骤A培养的菌种用5 30%。灭菌的生理盐水制成 IX 105CFU/mL的菌悬液，以2 10%的接种量接种于TSB液体培养基中，20 !35°C，100 200rpm振荡培养18 20h，获得种子液；C.发酵培养将步骤B中的种子液以2 10%的接种量接种于发酵培养基中， 20 ;35°C，100 200rpm振荡培养50 150h，至活菌数为0. 2 8X109CFU/mL，中止发酵；所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为葡萄糖1 5%，大豆粉饼1 5%，氯化钠1 3%，其余为水；D.微生物制剂的制备向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每IOOmL发酵液中加入5 30g沸石粉，100 200rpm振荡20 60min后静止20 60min，将上述发酵液于 40C 6000rpm离心20min，弃上清，每IOOg沉淀中加入20 40g沸石粉混勻后，于30 60°C 烘干2 5h。所述饲料添加剂优选为用于海参的饲料添加剂，添加剂量可以为海参饲料总重量的 0. 5 7%0。所述饲料添加剂可以为固态粉状制剂。为解决上述技术问题，本发明又提供了一种微生物制剂，所述微生物制剂的制备方法包括以下步骤A.平板培养复壮将低温保存的菌株接种于TSB固体平板培养基上，于22 33°C 培养14 38h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于 22 33°C培养14 36h ；B.种子液的制备将步骤A培养的菌种用5 30%。灭菌的生理盐水制成 IX 105CFU/mL的菌悬液，以3 10%的接种量接种于TSB液体培养基中，20 !35°C，100 200rpm振荡培养18 22h，获得种子液；C.发酵培养将步骤B中的种子液以3 10%的接种量接种于发酵培养基中， 23 ;35°C，100 200rpm振荡培养60 150h，至活菌数为0. 2 8X109CFU/mL，中止发酵；所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为葡萄糖1 5%，大豆粉饼1 5%，氯化钠1 3%，其余为水；D.微生物制剂的制备向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每IOOmL发酵液中加入6 30g沸石粉，100 200rpm振荡20 60min后静止20 60min，将上述发酵液于 40C 6000rpm离心20min，弃上清，每IOOg沉淀中加入20 40g沸石粉混勻后，于30 60°C 烘干2 5h。为解决上述技术问题，本发明再提供了一种微生物制剂的制备方法，包括以下步骤
A.平板培养复壮将低温保存的菌株接种于TSB固体平板培养基上，于18 37°C 培养14 36h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于 24 38°C培养12 36h ；B.种子液的制备将步骤A培养的菌种用5 30%。灭菌的生理盐水制成 1 X 105CFU/mL的菌悬液，以3 9%的接种量接种于TSB液体培养基中，20 ，100 200rpm振荡培养18 20h，获得种子液；C.发酵培养将步骤B中的种子液以2 10%的接种量接种于发酵培养基中， 20 ;35°C，100 200rpm振荡培养50 150h，至活菌数为0. 2 8X 109CFU/mL，中止发酵；所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为葡萄糖1 5%，大豆粉饼1 4%，氯化钠1 3%，其余为水；D.微生物制剂的制备向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每IOOmL发酵液中加入7 30g沸石粉，100 200rpm振荡20 60min后静止20 60min，将上述发酵液于 40C 6000rpm离心20min，弃上清，每IOOg沉淀中加入20 40g沸石粉混勻后，于32 60°C 烘干2 5h。为解决上述技术问题，本发明也提供了一种所述萎缩芽孢杆菌菌株 Aj080319IA-12作为饲料添加剂和/或微生物制剂的应用。为解决上述技术问题，本发明还提供了一种所述萎缩芽孢杆菌菌株 Aj080319IA-12作为肠道益生元的应用。为解决上述技术问题，本发明另提供了一种所述萎缩芽孢杆菌菌株 Aj080319IA-12在饲料添加剂、微生物制剂和/或肠道益生元的制备中的应用。本发明具有以下有益的技术效果1)所筛选的萎缩芽胞杆菌对海参病原菌有显著的拮抗作用，并且具有提高刺参生长速度、免疫力和肠道消化酶活力的功能。2)所筛选萎缩芽胞杆菌是从海参肠道中筛选的土著菌，对海参安全无毒、繁殖速度快、易于培养、对环境适应能力强，能较快的繁殖形成优势菌。3)所研制的微生物制剂使用操作方法简便，只需将该制剂添加到饲料中进行投喂即可，适用于幼参养殖培育和各种模式的刺参养殖过程中的疾病控制。4)使用本发明可减少或替代抗生素的使用，对减少药残、提高海参商品质量、保障食品安全具有重要作用。
图1为本发明实施例所述根据16S rDNA序列用PHYLIP软件获得的进化树结果图；图2为本发明实施例所述萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA_12制剂对海参体腔液酶活力的影响结果图；图3为本发明实施例所述Aj080319IA_12萎缩芽孢杆菌制剂对海参肠道酶活力的影响结果图。
具体实施例方式以下将结合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1 AJ080319IA-12菌株的筛选分离过程Aj080319IA_12菌株是中国水产科学研究院黄海水产研究所从野生刺参肠道中分离得到的。2008年中国水产科学研究院黄海水产研究所从青岛太平角海域抓获的野生刺参，在无菌条件下对刺参进行活体解剖，取其肠道，挤出肠道内容物，用灭菌的15%。的生理盐水冲洗肠道三次，将冲洗后的肠道勻浆，等比稀释后涂布在TSB培养基和2216E海水琼脂培养基上，选择合适稀释度的平板进行细菌的分离并通过多次划线培养纯化细菌，记录细菌的形态结构、数量并拍照；以刺参常见病原菌-灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)禾口嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophlia)为指示菌，利用点种法、十字交叉法和牛津杯法检测所分离细菌对刺参病原菌的抑菌作用，将其抑菌效果与抗生素的抑菌效果对比，筛选出抑菌效果显著的菌株；同时利用点种法和牛津杯法测定具有拮抗作用菌株的产酶能力；结果从中筛选出1个抑菌作用大于或接近抗生素抑菌效且产酶能力强的菌株，编号为Aj080319IA-12。实施例2 AJ080319IA-12菌株的形态特征菌株Aj080319IA_12的细胞革兰氏染色为阳性，菌体为杆状，芽孢染色结果显示有芽孢，荚膜染色显示菌体无荚膜。在TSB固体平板培养基上菌落黄色，表面有皱折，拉丝状，不透明，边缘不整齐，凸起，培养4 后菌落周围发黑色，液体培养时有菌膜且有沉淀生成。实施例3 16S rDNA 序列测定如图1所示，为本发明实施例所述根据16S rDNA序列用PHYLIP软件获得的进化树结果图。用于扩增细菌16S rDNA 的通用引物为 27F 5，-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3，和反向引物 1492R :5，-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3‘。以 Aj080319IA_12 菌株的基因组 DNA为模板扩增16S rDNA并进行转化测序，所得的序列见序列表。将所得的Aj080319IA-12 菌株的16SrDNA序列在Genbank中进行同源性比较，采用Clustalw软件进行多序列匹配排列，用系统发生推断软件包PHYLIP4. O进行统计分析和聚类分析，采用邻位相连法获得发育系统树(图1)，通过自举分析进行系统进化树的评估，自举的数据集为1000次。同源性比较结果表明，Aj080319IA_12菌株与萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)的同源性达到 99. 93%。实施例4:生理生化特征采用法国梅里埃公司API ID 32E鉴定试剂条分析菌株的生理生化特性，对于不确定的反应，采用北京陆桥技术有限责任公司的菌种鉴定管进行测定结果分别见表1。根据 ((Bergey' s Manual of Determinative Bacteriology))(第 9 片反)禾口 Gordon 〈〈芽子包杆菌》属的特征对菌株进行分类地位鉴定，该菌株具有萎缩芽孢杆菌生理生化特征，同时结合16S rDNA序列同源性分析结果，说明Aj080319IA-12菌株属于一种萎缩芽孢杆菌。表1 :Aj080319IA-12菌株API ID 32E生理生化反应结果
权利要求
1.一种萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12，其特征在于，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2010316。
2.一种饲料添加剂，其特征在于，包括萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010316。
3.根据权利要求2所述饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂的制备方法包括以下步骤A.平板培养复壮将低温保存的萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12接种于TSB固体平板培养基上，于20 35°C培养12 36h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于20 ;35°C培养12 36h ；B.种子液的制备将步骤A培养的菌种用5 30%。灭菌的生理盐水制成IX105CFU/mL 的菌悬液，以2 10%的接种量接种于TSB液体培养基中，20 35°C，100 200rpm振荡培养18 20h，获得种子液；C.发酵培养将步骤B中的种子液以2 10%的接种量接种于发酵培养基中，20 35°C, 100 200rpm振荡培养50 150h，至活菌数为0. 2 SXlOtFU/mL，中止发酵；所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为葡萄糖1 5%，大豆粉饼1 5%， 氯化钠1 3%，其余为水；D.微生物制剂的制备向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每IOOmL发酵液中加入5 30g沸石粉，100 200rpm振荡20 60min后静止20 60min，将上述发酵液于4°C 6000rpm 离心20min，弃上清，每IOOg沉淀中加入20 40g沸石粉混勻后，于30 60°C烘干2 5h。
4.根据权利要求2或3所述的饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂为用于海参的饲料添加剂，添加剂量为海参饲料总重量的0. 5 7%0。
5.根据权利要求2 4中任一项所述的饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂为固态粉状制剂。
6.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂的制备方法包括以下步骤A.平板培养复壮将低温保存的菌株接种于TSB固体平板培养基上，于22 33°C培养 14 38h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于22 33°C 培养 14 36h ；B.种子液的制备将步骤A培养的菌种用5 30%。灭菌的生理盐水制成1X 105CFU/mL 的菌悬液，以3 10%的接种量接种于TSB液体培养基中，20 35°C，100 200rpm振荡培养18 22h，获得种子液；C.发酵培养将步骤B中的种子液以3 10%的接种量接种于发酵培养基中，23 350C，100 200rpm振荡培养60 150h，至活菌数为0. 2 8 X 109CFU/mL,中止发酵；所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为葡萄糖1 5%，大豆粉饼1 5%， 氯化钠1 3%，其余为水；D.微生物制剂的制备向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每IOOmL发酵液中加入6 30g沸石粉，100 200rpm振荡20 60min后静止20 60min，将上述发酵液于4°C 6000rpm 离心20min，弃上清，每IOOg沉淀中加入20 40g沸石粉混勻后，于30 60°C烘干2 5h。
7.—种微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤A.平板培养复壮将低温保存的菌株接种于TSB固体平板培养基上，于18 37°C培养 14 36h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于M 38°C培养 12 36h ；B.种子液的制备将步骤A培养的菌种用5 30%。灭菌的生理盐水制成1X 105CFU/mL 的菌悬液，以3 9%的接种量接种于TSB液体培养基中，20 35°C，100 200rpm振荡培养18 20h，获得种子液；C.发酵培养将步骤B中的种子液以2 10%的接种量接种于发酵培养基中，20 35°C, 100 200rpm振荡培养50 150h，至活菌数为0. 2 SXlOtFU/mL，中止发酵；所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为葡萄糖1 5%，大豆粉饼1 4%， 氯化钠1 3%，其余为水；D.微生物制剂的制备向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每IOOmL发酵液中加入7 30g沸石粉，100 200rpm振荡20 60min后静止20 60min，将上述发酵液于4°C 6000rpm 离心20min，弃上清，每IOOg沉淀中加入20 40g沸石粉混勻后，于32 60°C烘干2 5h。
8.一种如权利要求1所述萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12作为饲料添加剂和/或微生物制剂的应用。
9.一种如权利要求1所述萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12作为肠道益生元的应用。
10.一种如权利要求1所述萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12在饲料添加剂、微生物制剂和/或肠道益生元的制备中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12，其特征在于，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010316。本发明所筛选的萎缩芽胞杆菌对海参病原菌有显著的拮抗作用，并且具有提高刺参生长速度、免疫力和肠道消化酶活力的功能。是从海参肠道中筛选的土著菌，对海参安全无毒、繁殖速度快、易于培养、对环境适应能力强，能较快的繁殖形成优势菌。本发明微生物制剂作为饲料添加剂，能提高海参特定生长率、降低海参死亡率、增强海参的免疫能力和肠道的消化酶活力，同时提高海参的抗病力，达到了抗菌、免疫、促生长多重效果，可减少和取代抗生素的使用。
文档编号C12N1/20GK102559533SQ201010602309
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者廖梅杰, 张正, 曲江波, 李彬, 王印庚, 王岚, 王崇明, 荣小军, 陈贵平, 陈霞 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所