一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，具体地说，是一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂。
【背景技术】
[0002] 细菌性疾病一直是困扰水产养殖业发展的重要原因之一。近年来，高密度集约化 的生产模式在促进水产业提高产量的同时，也使得细菌疾病发生的机会增大、频率增加、危 害加大；此外，抗生素使用导致的耐药性、药物残留以及对生态环境的破坏也成为社会关注 的焦点。因此，寻找抗生素的替代药物、探索新的防治方式已经成为水产病害防治研宄重要 方向之一。
[0003] 群体感应（Quorumsensing，简称QS)是指细菌能自发产生并释放一些特定的信 号分子，感知自身浓度的变化，进而调控相关基因的表达。目前，调节细菌群体感应的信号 分子主要有三种，（a)N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs)，是广泛存在于革兰氏阴性细菌中的群 体感应的信号分子；(b)自体诱导肽（Autoinducingpeptides，AIP)，AIP是一类短肽分子， 是革兰氏阳性细菌中常见的信号分子；（c)自体诱导物II类分子（AutoinducingII，AI2)， 是以费氏弧菌（Vibriofischeri)为代表的由luxS酶催化的AI2系统的信号分子。研 宄表明，在革兰氏阴性细菌中，如铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)、嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila)等，其生物被膜形成、有害毒素产生、致病因子释放等行为均受到 AHLs类信号分子的调节。Dong(2000)等人在赌样芽孢杆菌（Bacilluscereus)中发现了 aiiA基因，能够合成AHLs信号分子降解酶，阻断QS信号分子在细菌间的传递；尹守亮等 (2009)从胶州湾海域筛选出一株能够降解AHLs信号分子的真菌，表明海洋微生物也可以 作为QS抑制剂的潜在研宄对象；Bhavanath等（2013)发现紫杉状海门冬（Asparagopsis taxiformis)的粗提物能够降解AHLs信号分子，并且对铜绿假单胞菌生物膜有一定的抑制 作用。Defoirdt等（2011)首次从南美白对虾和海水鲈鱼等水产动物的肠道中分离出了能 够抑制哈氏弧菌（Vibrioharveyi)QS信号分子传递的芽孢杆菌，Natrah等（2011)分离出 一株能够抑制AHLs信号分子的微藻，该微藻能够阻断哈氏弧菌QS系统，降低其致病力。这 些研宄为探讨从群体感应角度防控水产细菌性疾病提供了理论依据和科学数据的支撑。芽 孢杆菌（Bcaillussp)具有易生产、便运输、耐储藏等特点，在水产养殖上可以起到净化水 质、防治疾病和促进生长等作用，是常用的益生微生物菌株。
[0004] 中国专利文献CN103525723A公开了一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢 杆菌，具有抑制细菌群体感应的作用，可用于制备防治水产细菌性病害的微生物制剂。但是 关于一种具有显著防治水产细菌性病害、提高存活率的短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制 剂目前还未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混 合制剂。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混 合制剂，所述的混合制剂的有效成分由短小芽孢杆菌和免疫增强剂组成，所述的短小芽孢 杆菌为具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌，保藏编号为CCTCCM2013240,所述的 免疫增强剂为维生素C、黄芪、杜仲、党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子，所述 的混合制剂中短小芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别为：短小芽孢杆菌14-16份、维生 素C10-12份、黄芪7-8份、杜仲4-5份、党参2-4份、当归3-5份、金银花6-8份、柴胡9-10 份、乌梅3-5份、石植皮4-6份、五味子9-10份。
[0007] 优选的，所述的混合制剂中短小芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别为：短小芽 孢杆菌16份、维生素C12份、黄芪8份、杜仲5份、党参4份、当归5份、金银花8份、柴胡 10份、乌梅5份、石植皮6份、五味子10份。
[0008] 优选的，所述的混合制剂的制备方法为将所述的短小芽孢杆菌经液体发酵或固态 发酵制成微生物菌剂，所述的微生物菌剂中短小芽孢杆菌活菌数为10 9-10ncfu/g，将所述 的微生物菌剂、维生素C、黄芪、杜仲、党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子分别 粉碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的混合制剂。
[0009] 优选的，所述的混合制剂作为水产饲料添加剂或水产养殖水体添加剂使用。
[0010] 优选的，所述的水产为淡水鱼类。
[0011] 优选的，所述的混合制剂在饲料中的添加量为1% -3%。
[0012] 本发明优点在于：
[0013] 本发明的混合制剂对鱼类的免疫保护率高达73-90%，能够显著提高鱼体抵抗嗜 水气单胞菌的感染能力，增强养殖鱼类的机体免疫力，显著抑制鱼类肠道致病菌的生长，促 进鱼体快速生长，提高养殖鱼类的增重率和抗病力。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0015] 本发明提供一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂，所述的混合制剂的有效成 分由短小芽孢杆菌和免疫增强剂组成，所述的短小芽孢杆菌为具有群体感应系统抑制作用 的短小芽孢杆菌，保藏编号为CCTCCM2013240,已证实其具有群体感应系统抑制作用。所 述的免疫增强剂为维生素C、黄芪、杜仲、党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子， 所述的混合制剂中短小芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别为：短小芽孢杆菌14-16份、 维生素C10-12份、黄芪7-8份、杜仲4-5份、党参2-4份、当归3-5份、金银花6-8份、柴胡 9-10份、乌梅3-5份、石植皮4-6份、五味子9-10份。
[0016] 所述的短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus)，保藏单位：中国典型培养物保藏中 心（CCTCC)，地址：武汉大学生命科学院保藏中心，保藏日期2013年6月2日，保藏编号为 CCTCCNO:M2013240。已证实其具有群体感应系统抑制作用。
[0017] 所述的混合制剂的制备方法为将所述的短小芽孢杆菌经液体发酵或固态发酵制 成微生物菌剂，所述的微生物菌剂中短小芽孢杆菌活菌数为10 9-10ncfu/g，将所述的微生 物菌剂、维生素C、黄芪、杜仲、党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子分别粉碎过 100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的混合制剂。
[0018] 实施例1短小芽孢杆菌液体发酵
[0019]将短小芽抱杆菌菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面培养基为常规 营养琼脂培养基，液体种子培养基为常规营养肉汤液体培养基；液体发酵培养基配方（W/ 乂）：葡萄糖2%，豆饼粉8%，玉米浆1%，]\%504*711 200.02%，似(：10.4%，腿2?04 0.1%， 皿11(：12 0.04%，发酵温度301：，通风培养24-4811。得到高浓度的发酵菌液，其中活菌数 109-10ncfu/g〇
[0020] 也可以将发酵菌液离心去除发酵液，得到湿菌泥，添加抗热保护剂后，喷雾干燥， 得到固体菌粉，活菌数10 9-10ncfu/g。
[0021] 实施例2短小芽孢杆菌固态发酵
[0022] 将短小芽抱杆菌菌株按斜面、