液体种子、固态发酵的顺序培养，斜面培养基为常 规营养琼脂培养基，液体种子培养基为常规营养肉汤液体培养基。将种子培养液以5-10% 的接种量接种到固态发酵培养基中进行固态发酵，发酵时间为24-48h，发酵温度30°C，发 酵产物烘干粉碎后，即得短小芽孢杆菌微生物菌剂。其中活菌数l〇9-l〇ncfu/g。
[0023] 其中固态发酵培养基由料和水组成，所述的料按总质量分数100%计，包括米糠 10%，麸皮25%，豆柏32%，玉米粉30%，酵母提取物2%，NaCl1%，料水比为1:1。
[0024] 实施例3混合制剂的制备
[0025]将所述的短小芽孢杆菌经固态发酵制成微生物菌剂，所述的微生物菌剂中短小芽 孢杆菌活菌数为l〇9-l〇nCfu/g，将所述的短小芽孢杆菌菌剂16份、维生素C12份、黄芪8 份、杜仲5份、党参4份、当归5份、金银花8份、柴胡10份、乌梅5份、石榴皮6份、五味子 10份。分别粉碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的混合制剂。
[0026] 实施例4混合制剂的制备
[0027]将所述的短小芽孢杆菌经液体发酵制成微生物菌剂，所述的微生物菌剂中短小芽 孢杆菌活菌数为l〇9-l〇nCfu/g，将所述的短小芽孢杆菌菌剂14份、维生素C10份、黄芪7 份、杜仲4份、党参2份、当归3份、金银花6份、柴胡9份、乌梅3份、石榴皮4份、五味子9 份。分别粉碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的混合制剂。
[0028] 实施例5混合制剂的制备
[0029]将所述的短小芽孢杆菌经固态发酵制成微生物菌剂，所述的微生物菌剂中短小芽 孢杆菌活菌数为l〇9-l〇ncfu/g，将所述的短小芽孢杆菌菌剂15份、维生素C11份、黄芪7 份、杜仲4份、党参3份、当归4份、金银花7份、柴胡10份、乌梅4份、石榴皮5份、五味子 10份。分别粉碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的混合制剂。
[0030] 实施例6混合制剂的水体泼洒效果实验
[0031]鲫鱼，购买自江苏徐州淡水鱼养殖中心，体重100±0.5g，提前饲喂10天，无任何 嗜水气单胞菌症状。饲料购买自宁波天邦股份有限公司，按照体重的3%饲喂。
[0032]在试验前先驯养一周确定无任合嗜水气单胞菌症状，然后取体重（100±2. 3)g的 鲫鱼90条，随机分为三组每组三个重复，每组10条，养殖在700X500X50mm，体积90L水 族箱中，保持水温16?20 °C。
[0033] 实验设计三个组，共90条，每组10条，三个重复，对照组：在水体中加入培养的嗜 水气单胞菌菌液l〇〇mL(经稀释后最终菌液浓度达到108cfu/mL，在先实验确定嗜水气单胞 菌的绝对致死浓度为1X108cfu/mL)，试验组加入嗜水气单胞菌菌液100mL和实施例3制备 得到的本发明的混合制剂l〇g，空白组为空白对照水体中不加入任何东西。每隔两天换水， 加入曝过气的自来水，和重新培养的菌液，记录鲫鱼的生长状况以及死亡数。
[0034] 在两周的饲养周期内，空白组没有任何的死亡现象；对照组所有样本在9天内全 部死亡，而水体中加入嗜水气单胞菌和本发明的混合制剂的试验组，在七天后达到稳定，最 终的存活率为90%。
[0035] 实施例7混合制剂促生长和攻毒实验
[0036] 生长实验：试验选择健康、规格、重量基本一致的鲫鱼，个体初均重约50g。随机分 组，设有对照组、试验一组、试验二组、试验三组和试验四组，每组设3个平行试验，每平行 组50尾试验鱼，共6个网箱（规格为250cmX150cmX100cm)。鲫鱼驯化30d后，对照组投 喂普通饲料，试验一组投喂添加3. 0%重量百分比本发明混合制剂（实施例3)的饲料，试验 二组投喂添加1.0%重量百分比本发明混合制剂的饲料，试验三组投喂添加3.0%重量百 分比本发明所述短小芽孢杆菌（不包括免疫增强剂的混合制剂）的饲料，试验四组投喂添 加3.0%重量百分比免疫增强剂（不包括短小芽孢杆菌的免疫增强剂）的饲料，饲养56d， 测定其生长的影响。
[0037] 攻毒实验：对照组、试验一组、试验二组、试验三组和试验四组每组随机抽取15尾 鲫鱼。lX101cfu/mL嗜水气单胞菌，按每100g鱼重腹腔注射菌液1.0ml，后放养于同样规 格容积的水泥池网箱中（规格为lOOcmXIOOcmXIOOcm)，并保证充足的氧气，每天观察鱼 体死亡情况，观察l〇d，统计存活率。
[0038] 具体试验结果见下表1。
[0039] 表1三组增重率和死亡率的对照
【主权项】
1. 一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂，其特征在于，所述的混合制剂的有效成 分由短小芽孢杆菌和免疫增强剂组成，所述的短小芽孢杆菌为具有群体感应系统抑制作用 的短小芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC M 2013240,所述的免疫增强剂为维生素C、黄芪、杜仲、 党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子，所述的混合制剂中短小芽孢杆菌和免疫 增强剂的重量份分别为：短小芽孢杆菌14-16份、维生素C 10-12份、黄芪7-8份、杜仲4-5 份、党参2-4份、当归3-5份、金银花6-8份、柴胡9-10份、乌梅3-5份、石榴皮4-6份、五味 子9-10份。
2. 根据权利要求1所述的混合制剂，其特征在于，所述的混合制剂中短小芽孢杆菌和 免疫增强剂的重量份分别为：短小芽孢杆菌16份、维生素C 12份、黄芪8份、杜仲5份、党 参4份、当归5份、金银花8份、柴胡10份、乌梅5份、石榴皮6份、五味子10份。
3. 根据权利要求1-2任一所述的混合制剂，其特征在于，所述的混合制剂的制备方法 为将所述的短小芽孢杆菌经液体发酵或固态发酵制成微生物菌剂，所述的微生物菌剂中短 小芽孢杆菌活菌数为l〇9-l〇ncfu/g，将所述的微生物菌剂、维生素C、黄芪、杜仲、党参、当 归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子分别粉碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即 得所述的混合制剂。
4. 根据权利要求1-2任一所述的混合制剂，其特征在于，所述的混合制剂作为水产饲 料添加剂或水产养殖水体添加剂使用。
5. 根据权利要求4所述的混合制剂，其特征在于，所述的水产为淡水鱼类。
6. 根据权利要求4所述的混合制剂，其特征在于，所述的混合制剂在饲料中的添加量 为 1% _3%〇
【专利摘要】本发明涉及一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂，所述的混合制剂的有效成分由短小芽孢杆菌和免疫增强剂组成，所述的短小芽孢杆菌为具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC M 2013240，所述的免疫增强剂为维生素C、黄芪、杜仲、党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子。本发明优点在于：能够显著提高鱼体抵抗嗜水气单胞菌的感染能力，增强养殖鱼类的机体免疫力，显著抑制鱼类肠道致病菌的生长，促进鱼体快速生长，提高养殖鱼类的增重率和抗病力。CCTCC NO.M201324020130602
【IPC分类】A61P37-04, A61K31-375, A61K35-742, A61K36-736, A61P3-00, A61K36-79, A61P31-04
【公开号】CN104523956
【申请号】CN201410751286
【发明人】宋增福, 许维素
【申请人】苏州埃瑞特生物技术有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月10日