一种乳杆菌三联活菌制剂及制备方法

一种乳杆菌三联活菌制剂及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种植物乳杆菌，其分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum），该菌株已于2014年2月24号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.8848。本发明还公开了一种乳杆菌三联活菌制剂，该制剂是由益生菌混合物和保护剂组成，所述益生菌混合物为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌冷冻干燥活菌粉组成。本发明还公开了制备乳杆菌三联活菌制剂的方法。本发明在大量实验的基础上筛选出黏附定植力最强的植物乳杆菌为主要益生菌，与嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌以及保护剂混合，制成活菌冻干菌粉，成为保健作用更强，并可常温长期保存的复合益生菌制剂。
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物产品，具体涉及一种乳杆菌三联活菌制剂及制备方法。 一种乳杆菌三联活菌制剂及制备方法

【背景技术】
[0002] 乳杆菌是人体肠道内的重要的生理性有益菌，它具有维持胃肠道正常的微生态平 衡，抑制病原菌的入侵和感染，增强机体免疫力，预防和抑制肿瘤发生，降低胆固醇以及抗 氧化等作用。早在1 9〇5年，俄国微生物学家梅切尼科夫就发现，高加索地区居民长寿者较 多，其原因是食用了大量含乳酸菌的酸奶，并指出含有保加利亚乳杆菌的酸奶能使人长寿。 此后，大量的乳杆菌菌株被分离筛选出来，并广泛应用于医疗和保健食品中。嗜酸乳杆菌 NCFM (Zacio知s NCFM)是一株已被广泛应用的商业化菌株，它最初是由 美国北卡罗纳州立大学的Μ. Speck、S. Cilliland和Τ· KlaenhammerTO年代从人体中分离 得到的，现被广泛应用于液态奶、酸奶、固态液化食品、婴幼儿食品和果汁。研究资料表明， 嗜酸乳杆菌NCFM产生的细菌素对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌以及梭菌等具 有较强的抑制能力，在体外对肠上皮样细胞Caco-2、HT-29也具有较强的粘附性能，能够缓 解乳糖不耐症和调节肠道菌群。鼠李糖乳杆菌LGG (ATCC53103) aaciMaciBi/rfe應 LGG)是由美国的Sherwood Gorbach和Barry Goldin两位研究人员于1980年从健康人体 的肠道中分离出来的。LGG可有效的降低革兰氏阴性菌产生内毒素的水平，抑制肠素性大肠 杆菌和鼠伤寒沙门氏菌对肠上皮细胞的粘附和侵袭，增强IgA对食物抗原的抵抗力，维持 肠粘膜的完整性和功能；鼠李糖乳杆菌LGG对抗生素治疗所引起的腹泻、腹痛有明显的治 疗效果，且鼠李糖乳杆糖LGG在任何研究情况下都无不良反应。Oksanen等[Oksanen PJ， Salminen S,Saxelin M,Hamalainen Ρ,Ihantola-Vormisto A,Muurasniemi-Isoviita L, Nikkari S, Oksanen T, Porsti I, Salminen E. Prevention of travellers' diarrhoea by Lactobacillus GG. Ann Med. 1990,22:53-56.] 在土耳其对来自芬兰的旅行者进行的研究中发现43. 8%旅行者患了腹泻，若一天两次 口服鼠李糖乳杆菌LGG后，治愈率可达98%以上；Hilton等【Hilton E，Kolakowski P， Singer C, Smith M. Efficacy of Lactobacillus GG as a Diarrheal Preventive in Travelers. J Travel Med. 1997，4:41-43】对美国去亚洲、东非、南美等地的旅行者腹泻 发病情况进行了研究，发现每人口服1粒鼠李糖乳杆菌LGG胶囊可预防旅行腹泻的发生，且 发现鼠李糖乳杆菌LGG对以前从未发生旅行者腹泻的人群具备更为有效的治疗效果。总 之，鼠李糖乳杆菌是一种安全的，且具有显著调节肠道菌群、改善肠道功能、预防和治疗腹 泻、提高机体免疫力等功能的菌株，目前已在全球30多个国家广泛应用。另外，还有植物杆 菌 2"V 299V)、干酪乳杆菌Z. casei Shirota、嗜酸乳杆菌 LB LB)以及大肠奸菌 Nisslel917 Nissle 1917)等菌株也在大量应用，且在临床治疗中具有较好的效果。
[0003] 乳酸菌进入肠道后，首先和肠黏膜表面相接触，通过识别特异性的受体并与之结 合，黏附定植于肠黏膜表面。这种黏附一方面通过竞争性的占位定植形成生物屏障，以阻止 病原菌与肠黏膜受体结合；另一方面也延长了乳酸菌影响宿主肠道免疫系统和微生态区系 的时间，以维持肠道的内稳态。因此，乳酸菌对肠黏膜上皮细胞的黏附和定植是其发挥生理 作用的前提和基础。
[0004]虽然目前在临床和保健食品中已大量应用了一些乳酸菌菌株，但由于乳酸菌的益 生性能具有菌株特异性，各分离菌株在黏附性能方面存在很大的差异。另外分离源和宿主 也会影响菌株的黏附性能，从而使得一些产品中的菌株不能长期定植于肠道发挥其应有的 益生作用，极大地影响了此类产品的作用效果。


【发明内容】

[0005]发明目的：本发明的第一个目的提供了一种植物乳杆菌。本发明的第二个目的 是提供了一种乳杆菌三联活菌制剂。本发明的第三个目的提供了上述乳杆菌三联活菌制剂 的制备方法。
[0006] 技术方案：为实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：一种植物乳杆菌，其 分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum),该菌株已于2014年2月24号保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 8848。
[0007] -种乳杆菌三联活菌制剂，该制剂是由益生菌混合物和保护剂组成，所述益生菌 混合物为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌冷冻干燥活菌粉组成。
[000S]按重量份数，上述植物乳杆菌5?15份、嗜酸乳杆菌3?5份、鼠李糖乳杆菌3?5份、 保护剂1(Γ20份。
[0009] 其中，上述益生菌混合物组成比为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌分别 为 5 :3 :3。
[0010] 其中，上述保护剂为15-20%的脱脂奶粉、5-10%的植物淀粉和5-20%的β -环糊 精。
[0011] -种制备乳杆菌三联活菌制剂的方法，该方法包括下列步骤：将MRS液体培养基 置于高压锅内，121°C灭菌2(Γ25分钟，冷却至30?37°C后，在无菌条件下分别接10%-15%的 植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌以及鼠李糖乳杆菌，然后置于37°C恒温培养箱中培养18-24h，获 得细菌培养物，将菌液以250(T3000rpm/min离心15~20min，得湿菌泥，加入等量保护剂后， 冷冻干燥获得冻干菌粉，然后将三种菌的冻千粉混合后，加入保护剂，过40目筛混合后灌 装胶囊或按常规方法制成颗粒剂。 t〇〇12] 本发明的菌种来源及生物学特性如下： 1.菌种来源 1)植物乳杆菌L2,由本室分离自健康人的肠道。肠镜检查时采用活检钳夹取肠黏膜组 织，立即置入无菌的匀浆器内研磨。待组织块完全匀浆后，加入无菌PBS进行系列稀释，最 后取相应稀释样品涂布于LAMVAB选择性培养基上，分别置于37°C的生化培养箱和厌氧培 养箱内孵育24lT48h。待平板长出菌落后，挑取黄绿色平板中呈浅绿色或浅白色光滑的中 小菌落，经革兰氏染色镜检，确定为革兰氏阳性杆菌的菌落进行反复划线分离，直至菌株形 态均一。筛选的菌株L2在LAMVAB平板上呈现出浅绿色或绿色的光滑菌落，直径约Γ2πιπι, 边缘整齐，呈白色环状，在MRS固体培养基上呈现出无色或白色的光滑菌落。革兰氏染色阳 性，无芽孢，菌体呈杆状或短杆状，长约1. 5飞μ m。在有氧和厌氧条件下均可生长，且在厌氧 状态下生长良好，产酸，不还原硝酸盐，不液化明胶，不产生H2S，吲哚试验阴性，触酶和氧化 酶试验均为阴性，联苯胺反应阴性，最适生长温度为35°C、0°C。采用API 50 CHL试剂盒的 不同种类的碳水化合物进行生化反应，生化结果鉴定为植物乳杆菌(见表1)。以菌株L2的 总DNA为模板，用引物10F和1500R进行PCR扩增，得到一段长约1. 4kb的PCR产物（图 1)，菌株 L2 的 1仍 rRNA 基因序列 GenBank 登录号为（Accession number: ER)88327)。将 菌株L2的16S rDNA序列与GenBank中的序列进行比较，表明与其同源性最高的模式菌株 相似性最局的是植物乳杆菌(Zactofecii/iAs 所以该菌株命名为植物乳杆菌 L2。该菌株已于2014年2月24号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保 藏编号为 CGMCCNo. 8848。
[0013] 表1 L2对碳水化合物代谢的分析

【权利要求】
1. 一种植物乳杆菌，其特征在于，其分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum),该菌株已于2014年2月24号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏编号为CGMCC No. 8848。
2. -种乳杆菌三联活菌制剂，该制剂是由益生菌混合物和保护剂组成，其特征在于，所 述益生菌混合物为权利要求1所述的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌冷冻干燥活 菌粉组成。
3. 根据权利要求2所述的乳杆菌三联活菌制剂，其特征在于，按重量份数，所述植物乳 杆菌5?15份、嗜酸乳杆菌3飞份、鼠李糖乳杆菌3?5份、保护剂1(Γ20份。
4. 根据权利要求2所述的乳杆菌三联活菌制剂，其特征在于，所述益生菌混合物组成 比为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌分别为5 :3 :3。
5. 根据权利要求2所述的乳杆菌三联活菌制剂，其特征在于，所述保护剂为15-20%的 脱脂奶粉、5-10%的植物淀粉和5-20%的β -环糊精。
6. -种制备权利要求2的乳杆菌三联活菌制剂的方法，其特征在于，该方法包括下列 步骤：将MRS液体培养基置于高压锅内，121°C灭菌20?25分钟，冷却至30~37°C后，在无菌 条件下分别接1〇%_15%的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌以及鼠李糖乳杆菌，然后置于37°C恒温 培养箱中培养18-24h，获得细菌培养物，将菌液以2500?3000 rpm/min离心15~20min，得湿 菌泥，加入等量保护剂后，冷冻干燥获得冻干菌粉，然后将三种菌的冻千粉混合后，加入保 护剂，过40目筛混合后灌装胶囊或按常规方法制成颗粒剂。
【文档编号】A61K35/74GK104189015SQ201410110029
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】王斌, 曹振芳 申请人:南京久腾医药科技有限公司