专利名称：新型枯草杆菌蛋白酶及制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和酶工程领域，更具体地，涉及新的热稳定性提高的枯草杆菌蛋白酶。
枯草杆菌碱性蛋白酶E是一种丝氨酸水解酶，它在洗涤剂、制革等工业中有广泛的应用，是一种重要的工业用酶。但也有稳定性差等缺点，国内外已有提高其稳定性的报道。
Asn218Ser突变既可提高枯草蛋白酶BPN’的活性及稳定性(BryanProteinsStruct.，Funct.，Genet.1986，1，326-34)，也可提高碱性蛋白酶E的活性和稳定性(Chen KeqinProc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90，5618-22)。
Asn118Ser突变同样可提高碱性蛋白酶E的活性和热稳定性(朱榴琴中国专利CN 1113953A)，这是国内唯一一例在未知位点上进行突变而使蛋白酶性能得到改良的报道。
然而，现有的枯草杆菌蛋白酶E及其变异蛋白的热稳定性仍不能令人满意，因此迫切需要热稳定性进一步提高的枯草杆菌蛋白酶E。
本发明的目的就是克服已有技术中的上述缺点，提供一种在热稳定性高的枯草杆菌蛋白酶E，从而解决热稳定性差的问题，扩大了在洗涤、制革等领域的应用范围。
在本发明的一个方面，提供了一种枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白，其特征在于，它含有Ser236Cys突变。此外，它还可以含有选自下组的突变Ala15Asp/Gly20His和Ser24His/Lys27Asp。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的DNA序列，它编码上述的含有Ser236Cys突变的枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白。
另一方面，本发明还提供了一种表达载体，它含有上述的编码本发明新型枯草杆菌蛋白酶E的DNA序列。此外，还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞被上述的表达载体所转化。
本发明还提供了一种生产本发明新型枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白的方法，该方法包括步骤(a)将编码本发明新型枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白的DNA序列可操作地连于表达调控序列，形成枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白表达载体；
(b)将步骤(a)中的表达载体转化入宿主细胞；(c)在适合表达该枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白的条件下进行培养，从而表达出该枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白；(d)分离纯化出该枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白。
此外，还提供了本发明新型枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白的用途，它被用于蛋白质水解反应。
在所附的附图中，
图1是本发明新型枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白BP-1和BW-1，以及野生型蛋白酶E的热稳定性曲线图。
图2是本发明的新型枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白以及野生型蛋白酶E在二甲基甲酰胺(DMF)中稳定性曲线图。
图3是在不同浓度的DMF下，本发明的新型枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白以及野生型蛋白酶E的活性曲线图。
图4是天然枯草杆菌蛋白酶E的DNA序列。
本发明是基于以下意外发现的基础上完成的将枯草(杆菌)蛋白酶E中第236位的丝氨酸(Ser)突变为半胱氨酸(Cys)之后，可显著提高蛋白的热稳定性。并且本发明的新型突变蛋白在非水介质中的稳定性也有显著提供。
在本发明中，“枯草杆菌蛋白酶E”指来自枯草杆菌的蛋白酶E，它可以是天然的野生型的蛋白酶E，也可以是生物衍生或重组的蛋白酶E。天然的野生型的枯草杆菌蛋白酶E的氨基酸序列示于SEQ ID No.2中，其核苷酸序列(包括两侧的部分非编码区域)示于图4。
如本文所用，术语“非水介质”指含有有机溶剂的介质，该介质可以是只含有一种有机溶剂，也可以是两种或多种有机溶剂所组成的混合有机溶剂。此外可以是有机溶剂和水的构成的混合溶剂。代表性是有机溶剂有乙腈、二甲亚砜、二甲基甲酰胺(DMF)等。较佳地，该非水介质中含有DMF。
本发明的新型蛋白酶(变体酶)可以这样进行制备根据已公开的枯草杆菌蛋白酶E的序列来合成引物，通过PCR法从枯草杆菌中扩增出枯草杆菌蛋白酶E的编码序列。然后，以枯草杆菌蛋白酶E的DNA序列，按本发明中指出的突变形式进行遗传修饰，进行遗传修饰的技术是本领域中已知的，例如可参见“Mutagenesisa Practical Approach”，M.J.McPherson，Ed.，(IRL Press，Oxford，UK.(1991)，其中例如包括定点诱变、盒式诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。
在获得了定点突变后的编码本发明新变体酶的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，在转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的突变蛋白酶。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新变体酶的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是原核细胞，更佳地是枯草杆菌。
本发明人经过多年研究，将118Ser，222Ala，60Asn，218Ser，103Arg等各种突变形式及其组合引入枯草杆菌蛋白酶E中，并结合计算机研究了碱性蛋白酶E-PMSF复合物的晶体结构(ChuProtein Eng.1995，8，211-5)。研究发现，Ser221处于同一α-螺旋上的Ser236也位于酶分子的表面，与活性中心的距离比较远，因此，引入Ser236Cys突变对活性中心不应该产生大的影响。然而，将Ser236Cys突变引入枯草杆菌蛋白酶E后，意外发现可显著提高突变蛋白的热稳定性和/或在非水介质中的稳定性，从而在此发现基础上完成了本发明。
此外，通过在其他位点上的进一步诱变，还产生在非水介质中稳定性更高和/或活性更高的枯草杆菌蛋白酶。
在本发明的一个实施例中，对236位进行了突变，从而形成了Ser236Cys突变体，该突变体酶(简称为变体酶)被命名为BP-1。
在本发明的另一个实施例中，还对15和20位进行了突变，从而形成了Ala15Asp/Gly20His/Ser236Cys突变体，该突变体酶(简称为变体酶)被命名为BU-1。
在另一实施例中，还对24和27位进行了突变，从而形成了Ser24His/Lys27Asp/Ser236Cys突变体，该突变体酶(简称为变体酶)被命名为BW-1。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1变体酶BP-1的制备将碱性蛋白酶E基因(包括信号肽和导肽部分的基因，共1.9Kb，SEQ ID No.3)插入pAlter-I(购自Promega公司)的EcoR I/Sal I位点。在定点突变时，参照Promega公司突变说明书进行突变，其中，所用的诱变引物为5’-GCG TTA ATTCTT TGCAAG CAC CCG(引入Ser236Cys突变)在上述引物序列中，斜黑体字表示突变位点，“Ser236Cys”表示将原氨基酸序列中第236位的Ser变为Cys，其余突变位点用类似方式进行表示。
用EcoR I/Sal I分别切出突变后的1.9Kb片段，插入pBE-2穿梭质粒中(郭兴华生物工程学报1991，7，224-9)，构建得到表达质粒pBP-1，转入枯草杆菌DB104，转化后的枯草杆菌表达变体酶BP-1。
表达变体酶BP-1的枯草杆菌BP-1(AprE)于1998年12月11日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC(中国，武汉)，保藏号为CCTCC M98021。
此外，变体酶BP-1成熟后的氨基酸序列分别示于SEQ ID No.1中。
实施例2变体酶BU-1和BW-1的制备基本上按实施例1的相同的步骤，不同点在于以实施例1中获得的Ser236Cys突变体基因为模板，用引物5’-G CCG GAT CTT CAC TCT CAACACTAC ACA GG引入Ala15Asp/Gly20His突变(产生BU-1)；同样以Ser236Cys突变体基因为模板，用引物5’-C ACA GGCCAT AAC GTAGACGTA GCT GT引入Ser24His/Lys27Asp突变(产生BW-1)其中，在上述引物序列中，斜黑体字表示突变位点，“Ser236Cys”表示将原氨基酸序列中第236位的Ser变为Cys，其余突变位点用类似方式进行表示。
结果制得表达质粒pBU-1和pBW-1和相应的转化后的宿主细胞，并制得变体酶BU-1和BW-1。
实施例3性能测定(1)热稳定性将本发明的变体酶BP-1和BW-1以及野生型枯草杆菌蛋白酶E置于水中，于50℃保温，每隔一定时间取样测定剩余酶活力，从而得出相对的热稳定性数据，结果示于图1。
由图1可见，BP-1的半寿期超过1小时，BW-1的半寿期约为0.5小时，而碱性蛋白酶E的半寿期不超过20分钟，BP-1的耐热性比天然酶高约3倍。因此，与天然酶相比，236位发生Ser236Cys突变的蛋白酶BP-1和BW-1的耐热性都有大幅提高，尤其是BP-1的热稳定性更高。
(2)在非水介质中的稳定性将各变体酶和野生型蛋白酶E置于不同浓度的DMF中，间隔一定时间后取样并测定剩余酯解活性。结果表明，本发明的变体酶(尤其BP-1)在非水介质中的稳定性也有显著提高(图2)。
(3)在非水介质中的酶活性按AbrahmsenBiochemistry(1991)，30，4151-9中所述的方法，以s-Ala-ala-Pro-Phe-pNA为底物，对酰氨键水解活性进行测定。测定各变体酶和野生型蛋白酶E在DMF中的酯解活性，其中体系中DMF浓度如表1所示。
测定数据列于表1和图3。如图3所示，可见，BP-1、BW-1、BU-1及WT的活性都随DMF溶度的升高而降低，其中BP-1的稳定性最高，BW-1与WT相似，而BU-1最低。由此可见，Ser236Cys突变体的耐热性及活性都得到了提高。
综上所述，具有Ser236Cys突变的变体酶是耐热性及活性都比碱性蛋白酶E高的蛋白酶，在DMF中的稳定性也比天然酶高，尤其是碱性蛋白酶E经Ser236Cys突变所产生的变体酶BP-1，性能尤为出色。
表1 BP-1、BW-1、BU-1及WT在不同DMF体系中的动力学常数
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人中国科学院上海生物工程研究中心(ii)发明名称新型枯草杆菌蛋白酶及制法和用途(iii)序列数目2(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度275个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.1AQSVPYGISQ IKAPALHSQG YTGSNVKVAV IDSGIDSSHP DLNVRGGASF 50VPSETNPYQD GSSHGTHVAG TIAALNNSIG VLGVSPSASL YAVKVLDSTG 100SGQYSWIING IEWAISNNMD VINMSLGGPS GSTALKTVVD KAVSSGIVVA 150AAAGNEGSSG SSSTVGYPAK YPSTIAVGAV NSSNQRASFS SAGSELDVMA 200PGVSIQSTLP GGTYGAYNGT SMATPHVAGA AALILCKHPT WTNAQVRDRL 250ESTATYLGNS FYYGKGLINV QAAAQ 275(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度275个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.2AQSVPYGISQ IKAPALHSQG YTGSNVKVAV IDSGIDSSHP DLNVRGGASF 50VPSETNPYQD GSSHGTHVAG TIAALNNSIG VLGVSPSASL YAVKVLDSTG 100SGQYSWIING IEWAISNNMD VINMSLGGPS GSTALKTVVD KAVSSGIVVA 150AAAGNEGSSG SSSTVGYPAK YPSTIAVGAV NSSNQRASFS SAGSELDVMA 200PGVSIQSTLP GGTYGAYNGT SMATPHVAGA AALILSKHPT WTNAQVRDRL 250ESTATYLGNS FYYGKGLINV QAAAQ27权利要求
1.一种枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白，其特征在于，它含有Ser236Cys突变。
2.如权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白，其特征在于，它还含有选自下组的突变Ala15Asp/Gly20His和Ser24His/Lys27Asp。
3.如权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白，其特征在于，它是变体酶BP-1，它具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
4.如权利要求2所述的枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白，其特征在于，它是变体酶BU-1或BW-1。
5.一种分离的DNA序列，其特征在于，它编码权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白。
6.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求5所述的DNA序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求6所述的表达载体所转化。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，它是枯草杆菌BP-1(AprE)CCTCC No.M98021。
9.一种生产权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白的方法，其特征在于，该方法包括步骤(a)将编码权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白的DNA序列可操作地连于表达调控序列，形成枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白表达载体；(b)将步骤(a)中的表达载体转化入宿主细胞；(c)在适合表达该枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白的条件下进行培养，从而表达出该枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白；(d)分离纯化出该枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白。
10.如权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶E突变蛋白的用途，其特征在于，它被用于蛋白质水解反应。
全文摘要
本发明提供了衍生自枯草蛋白酶E的变体酶,它含有Ser226CYs突变。它还含有选自下组的突变:Ala15Asp/Gly20His和Ser24His/Lys27Asp。本发明的变体酶热稳定性以及在非水介质中的稳定性都显著提高,因而可广泛应用于蛋白水解反应。本发明还提供了相应的编码序列、表达载体、转化的宿主细胞和制备方法。
文档编号C12N9/50GK1258745SQ9812674
公开日2000年7月5日 申请日期1998年12月31日 优先权日1998年12月31日
发明者杨永华, 蒋岚, 杨胜利 申请人:中国科学院上海生物工程研究中心