杀虫蛋白的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，特别是涉及一种Cry2Ab蛋白质通过在植物中 表达来控制东方黏虫为害植物的用途。
【背景技术】
[0002] 东方黏虫（Mythimna seperata)属鳞翅目夜蛾科，是一种主要以小麦、玉米、高粱、 大豆、水稻等粮食作物和牧草为危害对象的杂食性、迀移性、间歇暴发性害虫，在我国除新 疆地区尚未报道发生外，其他各地均有危害。东方黏虫喜食叶，三龄后能将整片叶咬食成缺 刻状，或吃光心叶，形成无心苗。三龄后到达暴食期，能将幼苗地上部分全部吃光，或将整 个植株叶片吃掉只留下叶脉，造成严重减产，甚至绝收；东方黏虫除喜食叶片外也可危害果 穗。
[0003] 玉米是中国重要的粮食作物，而近两年东方黏虫的危害呈暴发状态，2012年二代 东方黏虫危害玉米面积达到6495万亩，2013年则危害玉米5800万亩，严重影响到当地人口 的生存状况。为了防治东方黏虫，人们通常采用的主要防治方法有：农业防治、化学防治和 物理防治。
[0004] 农业防治是把整个农田生态系统多因素的综合协调管理，调控作物、害虫、环境因 素、创造一个有利于作物生长而不利于东方黏虫发生的农田生态环境。如在成虫产卵盛期 前选叶片完整、不霉烂的稻草8-10根扎成一小把，每亩30-50把，每隔5-7天更换一次（若 草把经用药剂浸泡可减少换把次数），可显著减少田间虫口密度；还可在幼虫发生期间放 鸭啄食。因农业防治必须服从作物布局和增产的要求，应用有一定的局限性，不能作为应急 措施，在东方黏虫爆发时就显得无能为力。
[0005] 化学防治即农药防治，是利用化学杀虫剂来杀灭害虫，是东方黏虫综合治理的重 要组成部分，它具有快速、方便、简便和高经济效益的特点，特别是东方黏虫大发生的情况 下，是必不可少的应急措施。目前化学防治方法主要是药液喷雾。但化学防治也有其局限 性，如使用不当往往会导致农作物发生药害、害虫产生抗药性，以及杀伤天敌、污染环境，使 农田生态系统遭到破坏和农药残留对人、畜的安全构成威胁等不良后果。特别值得一提的 是，2012年东方黏虫在东北地区大面积爆发，虽然政府投入了大量的人力、物力喷洒化学杀 虫剂，但是仍然造成了无法挽回的虫害减产，局部地区甚至绝收。
[0006] 物理防治主要根据害虫对环境条件中各种物理因素的反应，利用各种物理因素如 光、电、色、温湿度等以及机械设备进行诱杀、辐射不育等方法来防治害虫。目前应用最广 泛的是频振式杀虫灯诱杀，它利用害虫成虫的趋光性，近距离用光，远距离用波，引诱害虫 靠近，对东方黏虫成虫的防治具有一定的效果；但是频振式杀虫灯需要每天及时清理高压 电网上的污垢，否则会影响杀虫效果；并且在雷雨天不能开灯，在操作上还有电击伤人的危 险；此外安装灯的一次性投入较大。
[0007] 为了解决农业防治、化学防治和物理防治在实际应用中的局限性，科学家们经过 研宄发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植 物虫害。Cry2Ab杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的一种，是由苏云金芽孢杆菌库斯塔基亚种 (Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki，B.t. L )产生的不溶性伴抱结晶蛋白。
[0008] Cry2Ab蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性pH环 境下。蛋白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段和昆虫中 肠上皮细胞膜上表面上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病灶，破坏细胞膜内外的 渗透压变化及pH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。
[0009] 已证明转Cry2Ab基因的植株可以抵抗玉米螟、棉铃虫等鳞翅目（Lepidoptera)害 虫的侵害，然而，至今尚无关于通过产生表达Cry2Ab蛋白的转基因植株来控制东方黏虫对 植物危害的报道。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种杀虫蛋白的用途，首次提供了通过产生表达Cry2Ab蛋 白的转基因植株来控制东方黏虫对植物危害的方法，且有效克服现有技术农业防治、化学 防治和物理防治等技术缺陷。
[0011] 为实现上述目的，本发明提供了一种控制东方黏虫害虫的方法，包括将东方黏虫 害虫至少与Cry2Ab蛋白接触。
[0012] 进一步地，所述Cry2Ab蛋白存在于至少产生所述Cry2Ab蛋白的宿主细胞中，所述 东方黏虫害虫通过摄食所述宿主细胞至少与所述Cry2Ab蛋白接触。
[0013] 更进一步地，所述Cry2Ab蛋白存在于至少产生所述Cry2Ab蛋白的细菌或转基因 植物中，所述东方黏虫害虫通过摄食所述细菌或所述转基因植物的组织至少与所述Cry2Ab 蛋白接触，接触后所述东方黏虫害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对东方黏虫危 害植物的控制。
[0014] 所述转基因植物可以处于任意生育期。
[0015] 所述转基因植物的组织为叶片、茎杆、果实、雄穗、雌穗、花药或花丝。
[0016] 所述对东方黏虫危害植物的控制不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。
[0017] 所述植物来自玉米、大豆、水稻、小麦、高粱、谷子、青稞或牧草。
[0018] 所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述Cry2Ab蛋白的多核苷酸的植物。
[0019] 优选地，所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。所 述Cry2Ab蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
[0020] 在上述技术方案的基础上，所述植物还可以包括至少一种不同于编码所述Cry2Ab 蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。
[0021] 进一步地，所述第二种核苷酸编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶 抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶。
[0022] 优选地，所述第二种核苷酸编码CrylA. 105蛋白或Vip3A蛋白。
[0023] 进一步地，所述CrylA. 105蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序 列。
[0024] 更进一步地，所述第二种核苷酸具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
[0025] 可选择地，所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
[0026] 为实现上述目的，本发明还提供了一种Cry2Ab蛋白质控制东方黏虫害虫的用途。
[0027] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制东方黏虫害虫的植物的方法，包 括向所述植物的基因组中引入编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列。
[0028] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制东方黏虫害虫的植物种子的方 法，包括将由所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码Cry2Ab蛋白的 多核苷酸序列的种子。
[0029] 为实现上述目的，本发明还提供了一种培养控制东方黏虫害虫的植物的方法，包 括：
[0030] 种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括编码Cry2Ab蛋白的多核 苷酸序列；
[0031] 使所述植物种子长成植株；
[0032] 使所述植株在人工接种东方黏虫害虫和/或东方黏虫害虫自然发生危害的条件 下生长，收获与其他不具有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物 损伤和/或具有增加的植物产量的植株。
[0033] 本发明中所述的"接触"，是指昆虫和/或害虫触碰、停留和/或摄食植物、植物器 官、植物组织或植物细胞，所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞既可以是其体内表达 杀虫蛋白，还可以是所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞的表面具有杀虫蛋白和/或 具有产生杀虫蛋白的微生物。
[0034] 本发明术语"控制"和/或"防治"是指东方黏虫害虫至少与Cry2Ab蛋白接触，接 触后东方黏虫害虫生长受到抑制和/或导致死亡。进一步地，东方黏虫害虫通过摄食植物 组织至少与Cry2Ab蛋白接触，接触后全部或部分东方黏虫害虫生长受到抑制和/或导致死 亡。抑制是指亚致死，即尚未致死但能引起生长发育、行为、生理、生化和组织等方面的某种 效应，如生长发育缓慢和/或停止。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培 养以用于产物的消耗和/或生成。此外，含有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的控制东方 黏虫害虫的植物和/或植物种子，在人工接种东方黏虫害虫和/或东方黏虫害虫自然发生 危害的条件下，与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，具体表现包括但不限 于改善的茎杆抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增产等。Cry2Ab蛋白对东方黏虫的"控 制"和/或"防治"作用是可以独立存在的，不因其它可"控制"和/或"防治"东方黏虫害 虫的物质的存在而减弱和/或消失。具体地，转基因植物（含有编码Cry2Ab蛋白的多核苷 酸序列）的任何组织同时和/或不同步地，存在和/或产生，Cry2Ab蛋白和/或可控制东方 黏虫害虫的另一种物质，则所述另一种物质的存在既不影响Cry2Ab蛋白对东方黏虫的"控 制"和/或"防治"作用，也不能导致所述"控制"和/或"防治"作用完全和/或部分由所 述另一种物质实现，而与Cry2Ab蛋白无关。通常情况下，在大田，东方黏虫害虫摄食植物组 织的过程短暂且很难用肉眼观察到，因此，在人工接种东方黏虫害虫和/或东方黏虫害虫 自然发生危害的条件下，如转基因植物（含有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列）的任何组 织存在死亡的东方黏虫害虫、和/或在其上停留生长受到抑制的东方黏虫害虫、和/或与非 转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，即为实现了本发明的方法和/或用途，即 通过东方黏虫害虫至少与Cry2Ab蛋白接触以实现控制东方黏虫害虫的方法和/或用途。
[0035] 在本发明中，Cry2Ab蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个Cry 类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因 植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物 (第1亲本）可以通过遗传工程操作表达Cry2Ab蛋白质，第二种植物（第2亲本）可以通 过遗传工程操作表达Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质。通过第1亲本和第2亲 本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。
[0036] RNA干扰（RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。因此在本 发明中可以使用RNAi技术特异性剔除或关闭目标昆虫害虫中特定基因的表达。
[0037] 在分类系统上，一般主要根据成虫翅的脉序、连锁方式和触角的类型等形态特征， 将鳞翅目分为亚目、总科、科等，而夜蛾科是鳞翅目中种类最丰富的科，全球已经发现了超 过2万种夜蛾科昆虫，其中绝大部分为农业害虫；中国已报道夜蛾科昆虫有2110种，分属 18个亚科514个属，其中在中国最常见的夜蛾科害虫为为害棉花的棉铃虫和小地老虎、为 害水稻的大螟。尽管东方黏虫与棉铃虫、小地老虎、大螟同属于夜蛾科，除了在分类标准上 存在相似性，在其它形态结构上则存在极大差异；就好比植物中的草莓与苹果一样（同属 于蔷薇目蔷薇科），它们都有花两性，辐射对称，花瓣5片等特征，但是其果实以及植株形态 却是千差万别。东方黏虫不管是从幼虫形态还是成虫形态上来看，都具有其独特的特征。 例如东方黏虫具有迀飞的习性，每年3月至8月中旬随气流由南往北方向迀飞，8月下旬至 9月又随偏北气流向南迀移越冬；在北炜33度以北地区不能越冬。而同属于夜蛾科的棉铃 虫即使是在东北地区，仍然可以越冬而无需迀飞至南方温暖地区。
[0038] 同属夜蛾科的昆虫不仅在形态特征上存在较大的差异，同时在取食习性上也存在 差异。例如同为夜蛾科的棉铃虫，以钻蛀型为害棉花的棉铃或者玉米穗子，小地老虎为害玉 米等的茎基部，而东方黏虫则更加偏好于为害叶片，大发生时往往是将叶片吃光，仅留下茎 杆与叶脉。取食习性的不同，也暗示着体内消化系统所产生的酶和受体蛋白不同。而消化道 中产生的酶是Bt基因起作用的关键点，只有能够与特异性Bt蛋白相结合的酶或受体蛋白， 才有可能使得某个Bt基因对该害虫具有抗虫效果