胞再生成植物（步骤5:再生步骤）， 优选地，在含选择剂的培养基上生长的子叶节再生的组织块在固体培养基（Β5分化培养基 和Β5生根培养基）上培养以再生植物。
[0111] 筛选得到的抗性组织块转移到所述Β5分化培养基（Β5盐3. lg/L、B5维他命、2-吗 啉乙磺酸（MES) lg/L、蔗糖30g/L、玉米素（ZT) lmg/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、谷氨酸 50mg/L、天冬氨酸50mg/L、赤霉素 lmg/L、生长素 lmg/L、潮霉素50mg/L，ρΗ5·6)上，25°C下 培养分化。分化出来的小苗转移到所述B5生根培养基（B5盐3. lg/L、B5维他命、2-吗啉 乙磺酸（MES) lg/L、蔗糖 30g/L、琼脂 8g/L、头孢霉素 150mg/L、吲哚-3- 丁酸（IBA) lmg/L)， 在生根培养上，25°C下培养至约IOcm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于26°C下培 养16小时，再于20°C下培养8小时。
[0112] 第四实施例、用TaqMan验证转基因植株
[0113] 分别取转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和转入Cry2Ab_CrylA. 105核苷酸序列 的玉米植株的叶片约IOOmg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组 DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测Cry2Ab基因和CrylA. 105基因的拷贝数。同 时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
[0114] 检测Cry2Ab基因和CrylA. 105基因拷贝数的具体方法如下：
[0115] 步骤11、分别取转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株、转入Cry2Ab-CrylA. 105核苷 酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各l〇〇mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个 样品取3个重复；
[0116] 步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具 体方法参考其产品说明书；
[0117] 步骤13、用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓 度；
[0118] 步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为 80-100ng/μ I ；
[0119] 步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知 拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平 均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：
[0120] 以下引物和探针用来检测Cry2Ab核苷酸序列：
[0121] 引物 I :CTGATACCCTTGCTCGCGTC 如序列表中 SEQ ID N0:8 所示；
[0122] 引物 2 :CACTTGGCGGTTGAACTCCTC 如序列表中 SEQ ID N0:9 所示；
[0123] 探针 I :CGCTGAGCTGACGGGTCTGCAAG 如序列表中 SEQ ID NO: 10 所示；
[0124] 以下引物和探针用来检测CrylA. 105核苷酸序列：
[0125] 引物 3 :GCGCATCCAGTTCAACGAC 如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示；
[0126] 引物 4 :GTTCTGGACGGCGAAGAGTG 如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示；
[0127] 探针 2 :TGAACAGCGCCCTGACCACCG 如序列表中 SEQ ID NO: 13 所示；
[0128] PCR反应体系为：
[0129] JumpStartTM Taq ReadyMixTM (Sigma) ΙΟμΙ 5〇x引物/探针、混合物 Ιμ? 基因组DNA 3μΙ 水（ddH20) 6μ1
[0130] 所述50X引物/探针混合物包含ImM浓度的每种引物各45μ1，100μΜ浓度的探 针50 μ 1和860 μ I I X TE缓冲液，并且在4°C，贮藏在琥珀试管中。
[0131] PCR反应条件为：
[0132] 步骤 温度 时间 21 95〇C 5 分钟 22 95 "C 30 秒 23 60 〇C 1 分钟 24 回到步骤22，重复40次
[0133] 利用 SDS2. 3 软件（Applied Biosystems)分析数据。
[0134] 实验结果表明，Cry2Ab核苷酸序列和Cry2Ab_Cry 1A. 105核苷酸序列均己整 合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和转入 Cry2Ab-CrylA. 105核苷酸序列的玉米植株均获得了单拷贝的转基因玉米植株。
[0135] 按照上述用TaqMan验证转基因玉米植株的方法，对转基因大豆植株进行检测 分析。实验结果表明，Cry2Ab核苷酸序列和Cry2Ab-CrylA. 105核苷酸序列均己分别 整合到所检测的大豆植株的染色体组中，而且转入Cry2Ab核苷酸的大豆植株和转入 Cry2Ab-CrylA. 105核苷酸序列的大豆植株均获得了单拷贝的转基因大豆植株。
[0136] 第五实施例、转基因植株的抗虫效果检测
[0137] 将转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株、转入Cry2Ab_CrylA. 105核苷酸序列的玉 米植株、转入Cry2Ab核苷酸序列的大豆植株、转入Cry2Ab-CrylA. 105核苷酸序列的大豆植 株；相应的野生型玉米植株和大豆植株，以及经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株和大豆 植株对东方黏虫进行抗虫效果检测。
[0138] 1、转基因玉米植株的抗虫效果检测
[0139] 分别取转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株、转入Cry2Ab-CrylA. 105核苷酸序列 的玉米植株、野生型玉米植株和经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株（V3-V4期）的新鲜 叶片，用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，然后将玉米叶片去除叶脉，同时剪成 约IcmX4cm的长条状，取3片剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部的保湿滤纸上， 所述滤纸用蒸馏水润湿，每个培养皿中放10头东方黏虫（初孵幼虫），虫试培养皿加盖后， 在温度25-28°C、相对湿度70% -80%、光周期（光/暗）16:8的条件下放置3天后，根据 东方黏虫幼虫发育进度、死亡率和叶片损伤率三项指标，获得抗性总分（满分300分）：抗 性总分=100X死亡率+[100X死亡率+90X (初孵虫数/接虫总数）+60X (初孵-阴性 对照虫数/接虫总数）+IOX (阴性对照虫数/接虫总数）]+100 X (1-叶片损伤率）。转入 Cry2Ab核苷酸序列的共3个转化事件株系（Sl、S2和S3)，转入Cry2Ab-CrylA. 105核苷酸 序列的共3个转化事件株系（S4、S5和S6)，经Taqman鉴定为非转基因的（NGMl)共1个株 系，野生型的（CKl)共1个株系；从每个株系选3株进行测试，每株重复6次。结果如表I 和图3所示。
[0140] 表1、转基因玉米植株接种东方黏虫的抗虫实验结果
[0141]
【主权项】
1. 一种控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，包括将东方黏虫害虫至少与Cry2Ab蛋 白接触。
2. 根据权利要求1所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述Cry2Ab蛋白存 在于至少产生所述Cry2Ab蛋白的宿主细胞中，所述东方黏虫害虫通过摄食所述宿主细胞 至少与所述Cry2Ab蛋白接触。
3. 根据权利要求2所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述Cry2Ab蛋白存 在于至少产生所述Cry2Ab蛋白的细菌或转基因植物中，所述东方黏虫害虫通过摄食所述 细菌或所述转基因植物的组织至少与所述Cry2Ab蛋白接触，接触后所述东方黏虫害虫生 长受到抑制和/或导致死亡，以实现对东方黏虫危害植物的控制。
4. 根据权利要求3所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述转基因植物可 以处于任意生育期。
5. 根据权利要求3所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述转基因植物的 组织为叶片、茎杆、果实、雄穗、雌穗、花药或花丝。
6. 根据权利要求3所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述对东方黏虫危 害植物的控制不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。
7. 根据权利要求3至6任一项所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述植物 来自玉米、大豆、水稻、小麦、高粱、谷子、青稞或牧草。
8. 根据权利要求2至7任一项所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述接触 步骤之前的步骤为种植含有编码所述Cry2Ab蛋白的多核苷酸的植物。
9. 根据权利要求1至8任一项所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述 Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
10. 根据权利要求9所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述Cry2Ab蛋白的 核苷酸序列具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
11. 根据权利要求2至10任一项所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述植 物还可以包括至少一种不同于编码所述Cry2Ab蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。
12. 根据权利要求11所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷 酸编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素 、α -淀粉酶或过氧化 物酶。
13. 根据权利要求12所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷 酸编码CrylA. 105蛋白或Vip3A蛋白。
14. 根据权利要求13所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述CrylA. 105蛋 白的氨基酸序列具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
15. 根据权利要求14所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷 酸具有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列。
16. 根据权利要求11所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷 酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
17. -种Cry2Ab蛋白质控制东方黏虫害虫的用途。
18. -种产生控制东方黏虫害虫的植物的方法，其特征在于，包括向所述植物的基因组 中引入编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列。
19. 一种产生控制东方黏虫害虫的植物种子的方法，其特征在于，包括将由权利要求 18所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸 序列的种子。
20. -种培养控制东方黏虫害虫的植物的方法，其特征在于，包括： 种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸 序列； 使所述植物种子长成植株； 使所述植株在人工接种东方黏虫害虫和/或东方黏虫害虫自然发生危害的条件下生 长，收获与其他不具有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤 和/或具有增加的植物产量的植株。
【专利摘要】本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，所述控制东方黏虫害虫的方法包括：将东方黏虫害虫至少与Cry2Ab蛋白接触。本发明通过植物体内产生能够杀死东方黏虫的Cry2Ab蛋白来控制东方黏虫害虫；与现有技术使用的农业防治方法、化学防治方法和物理防治方法相比，本发明对植物进行全生育期、全植株的保护以防治东方黏虫害虫的侵害，且无污染、无残留，效果稳定、彻底，简单、方便、经济。
【IPC分类】A01H5-00, A01H4-00, A01H1-02, A01N47-44, A01P7-04, C12N15-84
【公开号】CN104604924
【申请号】CN201510029469
【发明人】陶青, 庞洁, 杨旭, 岳健婷, 张欣馨
【申请人】北京大北农科技集团股份有限公司, 北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月21日