融合杀虫蛋白Cry1Am、其编码基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种融合杀虫蛋白CrylAm、其编码基因 及应用。
【背景技术】
[0002] 虫害是造成农作物严重减产的一个主要因素，防治农业害虫最常见的手段就是使 用广谱化学杀虫剂和一些生物杀虫剂。化学杀虫剂多具有广谱、高毒的特点，在杀死目标 害虫的同时往往将很多益虫一起杀死，严重破坏生态平衡，并对环境造成严重污染；另一方 面，农药残留对人类、牲畜的健康也造成严重威胁。生物杀虫剂具有易降解、与环境高度相 容的特点，但在生产上需要重复施用，大大增加生产成本。为了弥补化学杀虫剂和生物杀虫 剂在农业生产应用中的弊端，科学家们将编码杀虫蛋白的基因导入到植物体内，培育出多 种转基因植物。自1996年至今，已经有多种转Bt基因杀虫作物获得批准进行商业化生产， 但这些抗虫转基因作物多使用CrylA类杀虫蛋白基因，杀虫蛋白基因的单一化、大面积使 用加速害虫抗性的产生，制约了转CrylA类抗虫转基因作物的应用年限。因此，需要不断寻 找具有高杀虫能力、而且能延缓害虫抗性产生的新型基因。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种对野生型和CrylAb/CryIAc抗性昆虫具有高杀虫能力 的新型融合杀虫蛋白CrylAm及其编码基因。
[0004] 本发明的另一目的是提供所述新型融合杀虫蛋白CrylAm及其编码基因的应用。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的一种融合杀虫蛋白CrylAm，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基 酸序列。
[0006] 本发明还提供上述融合杀虫蛋白的编码基因，基因 CrylAm包括编码CrylAb上游 658个氨基酸的核苷酸序列、编码30个氨基酸融合肽段的核苷酸序列、编码CrylIa蛋白结 构域III的核苷酸序列、编码CrylIe蛋白结构域I和II的核苷酸序列。
[0007] 本发明还根据玉米密码子的偏好性，对编码上述融合杀虫蛋白的基因 CrylAm进 行改造合成，所述基因的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0008] 应当理解的是，由于密码子具有简并性以及不同物种密码子所具有的偏爱性，本 领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。在本发明中，所述核苷酸序 列采用了玉米偏爱性密码子。
[0009] 本发明还提供了含有所述基因的表达载体，其中，所述表达载体包括诱导表达载 体和植物表达载体。
[0010] 本发明还提供了含有所述基因的宿主细胞、转基因细胞系和工程菌。
[0011] 本发明还提供了所述基因在提高植物抗虫性中的应用。
[0012] 进一步地，所述应用是在植物体内表达所述融合杀虫蛋白的编码基因，提高植物 的抗害虫能力。
[0013] 进一步地，所述植物包括玉米、水稻、棉花、大豆、高粱等。
[0014] 进一步地，所述害虫为鳞翅目害虫，包括但不限于亚洲玉米螟、棉铃虫和粘虫等。
[0015] 本发明还提供了所述基因在制备转基因植物中的应用。
[0016] 本发明提供的融合杀虫蛋白CrylAm，对野生型和CrylAb/CryIAc抗性昆虫具有高 杀虫活性，可以用于杀死亚洲玉米螟等鳞翅目害虫，提高转基因作物的杀虫能力。而且该融 合杀虫蛋白可以有效杀死对CryIAc蛋白产生抗性的玉米螟，能用于昆虫抗性防治。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明实施例1中构建的含有融合杀虫蛋白CrylAm的编码基因的诱导表 达载体pET30a-CrylAm的质粒图谱。
[0018] 图2为本发明实施例4中改造的植物表达载体pCAMBIA3301的质粒图谱。
[0019] 图3为本发明实施例4中含有融合杀虫蛋白基因的p3301Ubi-CrylAm植物表达载 体图。
[0020] 图4为本发明实施例6中试纸条检测转基因玉米中融合杀虫蛋白CrylAm的表达； 其中，1，非转基因玉米；2-5,转基因玉米。
[0021] 图5为本发明实施例7中转基因玉米温室接虫鉴定结果。
【具体实施方式】
[0022] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0023] 实施例1融合杀虫蛋白编码基因 CrylAm诱导表达载体的构建
[0024] 融合杀虫蛋白CrylAm的编码基因，包括编码CrylAb上游658个氨基酸的核苷酸 序列、编码30个氨基酸融合肽段的核苷酸序列、编码CrylIa蛋白结构域III的核苷酸序 列、编码CrylIe蛋白结构域I和II的核苷酸序列。所述融合杀虫蛋白CrylAm的氨基酸序 列如Seq ID No. 1所示。根据玉米密码子的偏好性，对编码融合杀虫蛋白CrylAm的基因进 行改造合成，基因 CrylAm的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示，基因序列委托上海生工合成 并构建到PUC57载体上，构建得到具有氨苄青霉素抗性的质粒pUC57-CrylAm。
[0025] 将质粒pUC57_CrylAm及质粒pET30a(购自美国Novagen公司）各取20ng加入 到50 μ L大肠杆菌感受态细胞Trans5 α中，冰浴30min ;42°C热激90sec，冰浴2min ;加入 300 μ L LB液体培养基，37°C低速振荡恢复培养Ihr后，将菌液涂于含相应抗生素的平板 上，晾干；37°C培养箱倒置培养15hr。挑取单克隆菌斑于IOmL含氨苄青霉素的LB液体培 养基中，37°C摇床震荡过夜培养，次日，按照天根生化科技（北京）有限公司质粒小提中量 提取试剂盒操作步骤提取质粒，并用NanoDrop 2000C微量紫外分光光度计对提取的质粒 定量。
[0026] 选择在质粒上有单一酶切位点且恰好位于基因两端的限制性内切酶BamHI和 HindIII双酶切质粒pUC57-CrylAm及pET30a，使基因与载体的两端具有相同的粘性末端。 pUC57-CryIAm酶切后，经琼脂糖胶电泳，对照Marker分别切取约4. 2kb大小的片段，用天根 生化科技（北京）有限公司胶回收试剂盒对核酸片段进行回收；质粒pET30a经双酶切后用 天根生化科技（北京）有限公司纯化试剂盒进行纯化回收。然后，按照T4连接酶的使用说 明将切胶回收的核酸片段与纯化回收的载体片段进行连接，即构建获得含有融合杀虫蛋白 CrylAm的编码基因的诱导表达载体pET30a-CryIAm(图1)。连接反应结束，取5 μ L连接产 物转化大肠杆菌Trans5 α，方法同上。
[0027] 挑取克隆菌斑于IOmL含相应抗生素的LB液体培养基中，37°C摇床震荡过夜培养， 次日，提质粒并定量。用BamHI和HindIII双酶切质粒，经琼脂糖电泳验证杀虫蛋白基因与 pET30a酶切位点连接的正确性。
[0028] 实施例2融合杀虫蛋白CrylAm的诱导与纯化
[0029] 将测序并酶切验证正确的质粒pET30a-Cry I Am转入购自全式金公司的菌株 Transetta(DE3)中，挑取单克隆，PCR扩增验证阳性菌斑。将检测阳性的菌斑接种于IOmL的 LB液体培养基中（含适宜抗生素），于37°C过夜振荡培养。将含有pET30a-CrylAm质粒的 大肠杆菌菌株Transetta (DE3)，按1:100接种到IOmL LB液体培养基中（含适宜抗生素）， 同样于37°C过夜振荡培养。
[0030] 次日，按1:200接种到200mL LB液体培养基中（含适宜抗生素），37°C，200rpm震 荡培养至〇〇6。。为0· 4-0. 6,加入IPTG至终浓度0· 5mM，16°C摇床，160rpm，震荡培养20hr左 右，诱导目的蛋白的表达。
[0031] 分别收集已诱导的菌体，5000rpm，低温下离心5min，弃上清液，加入1/20体积比 的重悬缓冲液（25mM Tris-Cl，150mM NaCl，15mM咪唑），加入10mg/mL的溶菌酶至终浓度为 100 μ g/mL，振荡后，冰上放置lOmin，超声波破碎，每隔3s超声4s，300w，15_20min，使菌体 充分破碎，破碎过程冰上操作。
[0032] 12000rpm，4°C，离心15min，取上清，用0· 45 μ m滤膜过滤。加入ImL混勾的50% 的Ni-NTA树脂，室温下于摇床上轻微振荡90min，使目的蛋白充分结合到Ni-NTA树脂上。 将结合有目的蛋白的Ni-NTA树脂装柱纯化。新打开包装的镍柱用70%乙醇平衡，然后用5 倍镍柱体积的重悬缓冲液平衡（含咪唑15mM)。
[0033] 低速向柱子中加入混匀好的蛋白上清和树脂的混合物，收集流出液，标记为L15。
[0034] 用洗脱液（25mM Tris-Cl，150mM NaCl，30mM咪唑）8mL洗涤，收集流出液，标记为 L30〇
[0035] 用洗脱液（25mMTris-Cl，150mM NaCl，IOOmM咪唑）4mL洗涤，收集流出液，标记为 LlOOo
[0036] 用洗脱液（25mMTris-Cl，150mM NaCl，250mM咪唑）IOmL洗涤，收集流出液，标记为 L250〇
[0037] 以上纯化过程均在4°C环境中操作，并严格避免交叉污染。
[0038] 纯化蛋白分别转入透析袋中，用透析液（25mM Tris-Cl，150mM NaCl)在4°C环境 中，转子搅拌下透析24hr，每8hr更换一次透析液。透析处理后，采用考马斯亮蓝蛋白定量 试剂盒对纯化的L250蛋白进行定量。同时，将杀虫蛋白L250收集的流出液进行SDS-PAGE 电泳检测。
[0039] 实施例3融合杀虫蛋白CrylAm的室内玉米螟杀虫试验
[0040] 供试玉米螟为敏感型玉米螟及对CrylAc蛋白产生抗性的玉米螟。在室内温度为 28 ± 1°C、光周期（L: D) 16: 8h、相对湿度70-80 %的条件下，采用人工饲料混合法进行室内 玉米螟虫试，将纯化的融合蛋白CrylAm及其它蛋白分别以25 μ g/g的量添加到人工饲料中 配成饲养饲料，将饲料均分到三个48孔细胞培养板中，每孔接玉米螟初孵幼虫一头，每个 浓度共接虫144头，7天后统计虫子死亡率。结果表明融合杀虫蛋白CrylAm对敏感型玉米 螟的杀虫效果比CrylAb、CrylIe或CrylIal明显提高，对抗性玉米螟的杀虫效果也明显提 高（表1)。
[0041] 表1原核表达纯化蛋白的杀虫率
[0042]
【主权项】
1. 融合杀虫蛋白CrylAm，其特征在于，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示，或该序列经 替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述蛋白的基因。
3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
4. 含有权利要求2或3所述基因的载体。
5. 含有权利要求2或3所述基因的工程菌。
6. 权利要求2或3所述基因在提高植物抗虫性中的应用。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗虫性包括对鳞翅目害虫的抗性。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述鳞翅目害虫包括但不限于亚洲玉米螟、 棉铃虫和粘虫。
9. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物包括玉米、水稻、棉花、大豆、高粱。
10. 权利要求2或3所述基因在制备转基因植物中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种新型的融合杀虫蛋白Cry1Am及其编码基因，该融合杀虫蛋白对野生型和Cry1Ab/Cry1Ac抗性昆虫具有高杀虫活性，可以用于杀死亚洲玉米螟等鳞翅目害虫，提高转基因作物的杀虫能力。而且该融合杀虫蛋白可以有效杀死对Cry1Ac蛋白产生抗性的玉米螟，能用于昆虫抗性防治。
【IPC分类】C07K19-00, C12N15-62, C12N15-82, A01H5-00
【公开号】CN104861074
【申请号】CN201510175515
【发明人】刘允军, 王国英, 张煜文, 刘艳
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年4月14日