本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及植物抗旱相关蛋白AsTMK1及其编码基因和应用。
背景技术：
：小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、盐碱等逆境胁迫条件严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦粮食安全。蛋白激酶是一类催化蛋白质磷酸化反应的酶，目前研究比较多的是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的促分裂原活化蛋白激酶(MitogenActivatedProteinKinase,MAPK)。在拟南芥原生质体中，MKK2能被冷、盐胁迫激活，因此，克隆、分离抗逆相关MAPK蛋白激酶基因改良和提高作物的抗逆性具有非常重要的意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种植物抗旱相关蛋白AsTMK1。本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱相关蛋AsTMK1的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。本发明的另一目的提供上述植物抗旱相关蛋白AsTMK1的应用。本发明所提供的抗旱相关蛋白AsTMK1，来源于燕麦，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明的蛋白激酶由371个氨基酸残基组成，是MAPK类蛋白激酶。自SEQIDNO.1的氨基末端第20-40位氨基酸残基是ATP结合域，自SEQIDNO.1的第116-138位氨基酸残基为丝氨酸/苏氨酸结合域。为了使蛋白AsTMK1便于纯化，可在由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL根据本发明所公开的SEQIDNO.1序列，本发明的转录因子AsTMK1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。根据本发明的AsTMK1编码基因具有如SEQIDNO.2所示cDNA序列。含有AsTMK1基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有AsTMK1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用AsTMK1构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有AsTMK1基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的MAPK蛋白激酶AsTMK1基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：拟南芥、小麦、燕麦、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。本发明以燕麦(AvenasativaL.)为实验材料，得到了抗逆相关的AsTMK1蛋白及其编码基因，并将其导入小麦，显著提高了转基因小麦的抗旱性。本发明的抗旱相关蛋白及其编码基因对改良、增强小麦抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。附图说明图1显示AsTMK1转基因小麦分子检测，其中，M：Marker；1：H2O对照；2：阴性对照；3-10：AsTMK1转基因植株样品。图2显示AsTMK1转基因小麦的抗旱鉴定结果。具体实施方式以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。实施例1：燕麦抗旱、耐盐相关AsTMK1基因的cDNA克隆。对生长30天左右的燕麦幼苗进行干旱处理5小时，用Trizol提取燕麦总RNA。应用5’RACE试剂盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18373-019)获得AsTMK1基因的全长序列1113bp。用Trizol提取燕麦幼苗的总RNA，用superscriptII(invitrogen)反转录酶反转录获得到cDNA。根据AsTMK1基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：P1：5’-ATGGACGGCGCTCCGGTGCC-3’，P2：5’-TTACGCGTCGACGTATCGGAA-3’。对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1kb左右的条带。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-TEasy(Promega)连接，参照Cohen等的方法(ProcNatlAcadSci，69:2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-TEasy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的AsTMK1基因的开放阅读框(ORF)为SEQIDNo.2的自5’末端第1至1113位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白质。将含序列SEQIDNo.2所示AsTMK1基因的重组载体命名为pTE-AsTMK1。将AsTMK1基因的序列进行比对，在燕麦中未发现同源蛋白基因，证明AsTMK1基因是一个新的基因。进一步用引物P1和P2在燕麦基因组中进行扩增，结果显示该基因的基因组序列大小与cDNA长度大小一致，不含有内含子序列。实施例2：用AsTMK1基因增强植物的抗旱性1、重组表达载体的构建1)Ubi-AsTMK1重组表达载体的构建以燕麦的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有KpnI和BamHI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后KpnI和BamHI双酶切PCR产物回收，将酶切产物正向插入载体pNT112的Ubi启动子之后的KpnI和BamHI酶切位点之间，得到重组载体Ubi::AsTMK1。引物序列如下：AsTMK1[KpnI]5’-TCAGGTACCATGGACGGCGCTCCGGTGCC-3’AsTMK1[BamHI]5’-GGGGATCCTTACGCGTCGACGTATCGGAA-3’2、转基因小麦获得和功能鉴定1)转基因小麦材料的获得将上述构建的重组表达载体pUbi::AsTMK1分别用冻融法转化根癌农杆菌C58C1，再用pUbi::AsTMK1的根癌农杆菌C58C1转化小麦，用含200mg/LBasta的MS培养基进行筛选，得到阳性转基因植株。将筛选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4。P3(上游引物):5’-ATTGATGAACATGTTCAAAG-3’，P4(下游引物):5’-CTCCGTGACGGCGTGTTCAT-3’。对Ubi::AsTMK1转基因小麦进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得650bp左右条带，结果获得转Ubi::AsTMK1小麦60株(图1)。同时将pNT112空载体导入小麦，方法同上，作为对照，获得10个株系的转空载体小麦，筛选获得的转基因小麦用T2代表示。2)AsTMK1转基因小麦抗旱性鉴定对AsTMK1转基因品系进行水旱地产量鉴定。在北京房山水地小区中，HF-1、HF-17、HF-33、HS-18、HS-19等5个AsTMK1转基因品系小区产量比对照京冬18分别增产4.8-9.4％之间，穗粒数、千粒重均比对照明显增加。在旱地小区中，HF-1、HF-17、HF-33、HS-18、HS-19转基因品系分别比对照京冬18增产4.03％至10.59％，这些转基因品系在水旱地增产稳定，穗粒数、千粒重别比对照均有增加，提高了转基因小区产量及抗旱性(表2，图2)。HS-19转基因品系具有繁茂性、丰产性好，持绿性和抗旱性显著增强等特点(图2)。表2、AsTMK1转基因品系在北京房山旱地小区产量比较<110>北京市农林科学院<120>植物抗旱相关蛋白AsTMK1及其编码基因和应用<160>2<210>1<211>371<212>PRT<213>燕麦<400>1MDGAPVPEFRPTMTHGGRFLLYNIFGNQFEITVKYQPPIMPIGRGAYGIVCSVMNFETRE60MVAIKKIANAFDNNMDAKRTLRETKLLRHLDHENIVGLRDVIPPAIPQSFNDVYIATELM120DTDLHHIIHSNQELSEEHCQYFLCQLLRGLKYIHSTNVIHRDLKPSNLLLNASCDLKICD180FGLARPSSESDMMTEYVVTRWYRAPELLLNSTDYSAAIDVWSVGCIFMELINCAPLFPGR240DHMHQMRLITEVFGTPTDDLGSIRNEEARRYMRHLPQFPCRPFPGQFPQVQPAALDLIER300MLTFNPLQRITVEEALEHPYLERLHDVADEPICTDPFSFDFEQHPLTEDQMKLLIFNEAL360KLNPNFRYVDA371<210>2<211>1080<212>DNA<213>燕麦<400>1atggacggcgctccggtgcccgagttccggccgacgatgacgcacggcggccgcttcctc60ctgtacaacatattcggcaaccagttcgagatcacggtcaagtaccagccgccgatcatg120cccatcggccgcggcgcctacgggatcgtctgctcggtgatgaacttcgagacgagggag180atggtggcaatcaagaagatcgcaaacgcctttgacaacaacatggatgccaagcgcacg240ctccgggagaccaagctcctcaggcacctcgaccacgagaacatagtaggcctccgagat300gtgatcccaccggcgatcccgcagtccttcaacgacgtctacatcgccaccgagctcatg360gacacggacctccaccacataatccactccaaccaagaactctcagaagaacactgccag420tacttcttgtgccaactgctgcgcggcctcaagtacatccactcga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