本发明克隆表达了一种D-乳酸氧化酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。
背景技术：
D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一种以FAD(FMN)为辅酶的α-羟酸氧化酶(习惯上均称之为D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物传感器中测定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生产丙酮酸。也有被用于光学纯α-羟酸的制备(中国专利201210109290.4)
目前为止，已经在迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等中发现了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for a branched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)
本发明首次从奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶不仅可以氧化(R)-α-羟酸，而且可以氧化(R)-α-羟酸酯，该反应与NAD(NADP)为辅酶的乳酸脱氢酶参与的反应相比逆反应极微弱，可应用于光学纯(S)-α-羟酸酯和(S)-α-羟酸的制备。
技术实现要素：
本发明从奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)中克隆得到了一种以FAD为辅酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性，并进行了应用研究。
本发明的技术方案如下：
1、菌株
本发明D-乳酸氧化酶基因的来源菌株为：Proteus mirabilis ATCC 25933，购自美国ATCC菌种库。
2、D-乳酸氧化酶基因的克隆
提取Proteus mirabilis ATCC 25933菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出D-乳酸氧化酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。
3、D-乳酸氧化酶表达与纯化
将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。
4、D-乳酸氧化酶的酶学性质分析
以D-乳酸为底物研究pH对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。
以D-乳酸为底物研究温度对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。
D-乳酸氧化酶的底物特异性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-对羟基苯乳酸、D-酒石酸、D-苹果酸、D-扁桃酸、D-丹参素。
酶活测定方法为：根据Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法进行。
5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羟酸酯
拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液。(R)-α-羟酸酯中的α-羟基被脱氢氧化成对应的α-酮酸酯，(S)-α-羟酸酯不被氧化。
产物(S)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价：
对映体过量值％e.e＝[(SS-SR)/(SS+SR)]×100％
(S)-α-羟酸酯得率(％)＝(SS/S0)×100％
式中SR为反应后(R)-对映体的峰面积，SS为反应后(S)-对映体的液相色谱峰面积，S0为反应前(R)-和(S)-对映体的液相色谱峰面积之和。
产物测定液相色谱条件为：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，检测波长210nm，进样量20μL。
所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。
所述的α-羟酸酯，根据中国专利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。
本发表明的有益之处：从Proteus mirabilis ATCC 25933中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶可以氧化(R)-α-羟酸和(R)-α-羟酸酯，可用于规模化制备手性纯(S)-α-羟酸酯，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
实施例1
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。
1、Proteus mirabilis ATCC 25933DNA的提取
将Proteus mirabilis ATCC 25933菌株在LB培养基中培养12h，12,000rmp/min离心10min得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌体基因组总DNA，放冰箱备用。
2、大肠杆菌感受态制备
(1)接种E.coli DH5α和BL21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。
(2)按1％接种量接种于50mL LB培养基中，37℃培养至OD600约0.6(约2～3h)。
(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃离心5min。
(4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃离心5min。重复2次。
(5)弃上清，加入1.5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液(含15％甘油)，轻轻悬浮菌体，然后按每个离心管(1.5mL)加入100μL菌液分装，-70℃冰箱保藏备用。
3、D-乳酸氧化酶基因的克隆
(1)引物设计
设计引物序列为：
引物1：5'GCCGGGATCCATGAAAATTGTTTCCTATAGTACTA 3'
引物2：5'GCCGTCTAGACTTTCACTTCGTTAGGTGAT 3'
(2)PCR扩增
用以上合成的两条引物，以Proteus mirabilis ATCC 25933的基因组DNA为模板进行PCR扩增。
本步骤中扩增体系为：
扩增程序为：
98℃，10min
98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反应30个循环
72℃，10min
PCR产物送华大基因测序后得到该酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根据该基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
(3)双酶切和连接
将pColdⅡ质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴下双酶切1h。将DNA片段克隆到pColdⅡ载体上，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，无菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下连接12h-16h。
(4)转化
步骤：
1在连接体系中加入100μl DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。
2放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。
3立即冰浴2min。
4加入1ml不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。
5将菌体均匀涂布在含抗生素的LB平板上。
6培养24h长势良好。挑单菌落进行菌落PCR，核酸电泳验证，提取重组质粒。将重组质粒导入BL21大肠杆菌感受态中，保存备用。
实施例2
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的诱导表达及分离纯化。
1、加500μl重组菌液到50ml LB培养液中。37℃培养2.5h，15℃下静置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷诱导培养24h。将发酵液进行离心(8000rmp/min，10min)得到菌体，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(20mmol/L，pH 7.0)复溶菌体，超声破碎仪破碎，离心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。
2、将步骤1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统操作进行镍柱纯化，洗脱方法为：将A1、A2、B1、B2四根管路都放进水里，设置system flow 20ml/min流速，进行排气。然后设置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均匀流出后装柱子，平衡十分钟之后把A1放进结合液中，B1放进洗脱液中，再进行排气一次，平衡二十分钟，然后上样粗酶液，用500mM的高浓度咪唑缓冲液(B1所处溶液)梯度洗脱目的蛋白，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来得到纯化的酶。纯化后的酶经冷冻干燥备用。
实施例3
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适温度。以D-乳酸为底物，将底物与pH为8.0的磷酸缓冲液在30-60℃不同的温度条件下水浴15min，测定D-乳酸氧化酶的酶活，确定酶的最适反应温度为50℃。
实施例4
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适pH值。以D-乳酸为底物，将底物在pH 3-9，50℃水浴15min测定酶的酶活，结果发现在pH 8.0条件下D-乳酸氧化酶酶活最高。
实施例5
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶与不同底物的反应特性，列于表2中。
表2 D-乳酸氧化酶对不同底物的活性
实施例6
根据发明内容中的方法拆分各种外消旋α-羟酸酯，结果如下表所示：
表3拆分各种外消旋α-羟酸酯的效果
由上表可以看出，当在反应时间充分时，可以得到各类高光学纯的(S)-α-羟酸酯，该酶的光学专一性非常好。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种氧化酶及其应用
<130> No
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1770
<212> DNA
<213> Proteus mirabilis ATCC 25933
<400> 1
atgaatgaga gtagcagctc cacaaaccag cattttattc gtaagttaga aggtattgtc 60
ggtaaaaaac atgtattaac ccaagagcat aaaacagagc gatatcgtaa agggtttcgt 120
tccggacagg gaaaagcgct ggcagtggta ttccccggct ctttattaga acagtggcgt 180
atttttaaaa cctgtgttga agccgataaa attattatta tgcaagcggc aaatactggg 240
ttaacagaag gttcaacccc cagtggtgat gactatgatc gtgatattgt tatcatcagt 300
accttgcgcc aagataaaat acaagttctt tctgaatata accaagttat tgcctttcct 360
ggcagtacat tatggcactt agaaaaagta ttaaagccat taggaagaga gccacattca 420
gtgatagggt cttcttgtat tggtgcttcg gtgattggag gcatttgtaa taactcaggg 480
ggggcattag tgcgccgcgg tcctgcttat actgagttat ctctttatgc ccgtgttaat 540
gaacaaggtg aagcagagct tatcaaccat ttgggaattg atttaggtga cactccggaa 600
gagatattaa ccaatctgga taatcgacat tatcatgcga aacaaattca tgcgacggat 660
aaactggcat ctgatcatga atatagtgag cgagtacgtg atattgatgc agatacacca 720
tctcgattta ataatgacga aagacgtctc tttgaagcgg cgggaagcgc cggtaagctc 780
tctgtttttg ccgtgagatt agatactttc cctgctgatc atcgcacaca agttttctat 840
attgggacca atgatcctga tgagttagaa gatatccgtc gccatattct cagtcaattt 900
aaggtattac ccgttgcggg tgagtatatg catcgaagtt actacaagat ggcagaagtt 960
tatggcaaag atactttttt aattattgat aagttaggta cagataagat gccagcatta 1020
tttgctatta aagggcgtgt tgatgctgtt cttaataaag tgccattttt acctaagaat 1080
ctaactgata gaacaatgca attgatgagt aagttatggc ctgctcattt acctgctcgt 1140
atgacagaat atcgcgataa atatgagcat catttaatgc taagaatggc ggatagtggt 1200
atagaagaag cctcaactta tttaaaagaa tattttaaac atgccacggg ggattatttc 1260
gaatgtacag aagaagaagg taataaagcc tttttacatc gttttgccgc cgcgggtgct 1320
gcggtgcgtt atcatgccgt tcatattaac gatgtggaag atgtgctacc tttggatatt 1380
gcattgcgtc gtaatgatcg agattggttt gaaaaactgc ctcctgaaat agaaaaccaa 1440
ttgctctata aattgtactg tggtcacttt atgtgtcacg ttatgcatca agattatatt 1500
attaaaaaag gtgttgacgc taaggcgctt aaagcacaga tgttagcctt actagacaaa 1560
cgtggtgcgg aatatccagc agagcataat gtagggcatc tctattatgc aaaaccgcaa 1620
ttaaaagcgt tttataaaca taacgatccg acaaatagca tgaacccagg cattggtaaa 1680
acctcaaaat taaaatattg gggagaagag tgtggttgcg ggcataatca taatcaagct 1740
gaagttaatc atatagaaaa caaagaataa 1770
<210> 2
<211> 589
<212> PRT
<213> Proteus mirabilis ATCC 25933
<400> 2
Met Asn Glu Ser Ser Ser Ser Thr Asn Gln His Phe Ile Arg Lys Leu
1 5 10 15
Glu Gly Ile Val Gly Lys Lys His Val Leu Thr Gln Glu His Lys Thr
20 25 30
Glu Arg Tyr Arg Lys Gly Phe Arg Ser Gly Gln Gly Lys Ala Leu Ala
35 40 45
Val Val Phe Pro Gly Ser Leu Leu Glu Gln Trp Arg Ile Phe Lys Thr
50 55 60
Cys Val Glu Ala Asp Lys Ile Ile Ile Met Gln Ala Ala Asn Thr Gly
65 70 75 80
Leu Thr Glu Gly Ser Thr Pro Ser Gly Asp Asp Tyr Asp Arg Asp Ile
85 90 95
Val Ile Ile Ser Thr Leu Arg Gln Asp Lys Ile Gln Val Leu Ser Glu
100 105 110
Tyr Asn Gln Val Ile Ala Phe Pro Gly Ser Thr Leu Trp His Leu Glu
115 120 125
Lys Val Leu Lys Pro Leu Gly Arg Glu Pro His Ser Val Ile Gly Ser
130 135 140
Ser Cys Ile Gly Ala Ser Val Ile Gly Gly Ile Cys Asn Asn Ser Gly
145 150 155 160
Gly Ala Leu Val Arg Arg Gly Pro Ala Tyr Thr Glu Leu Ser Leu Tyr
165 170 175
Ala Arg Val Asn Glu Gln Gly Glu Ala Glu Leu Ile Asn His Leu Gly
180 185 190
Ile Asp Leu Gly Asp Thr Pro Glu Glu Ile Leu Thr Asn Leu Asp Asn
195 200 205
Arg His Tyr His Ala Lys Gln Ile His Ala Thr Asp Lys Leu Ala Ser
210 215 220
Asp His Glu Tyr Ser Glu Arg Val Arg Asp Ile Asp Ala Asp Thr Pro
225 230 235 240
Ser Arg Phe Asn Asn Asp Glu Arg Arg Leu Phe Glu Ala Ala Gly Ser
245 250 255
Ala Gly Lys Leu Ser Val Phe Ala Val Arg Leu Asp Thr Phe Pro Ala
260 265 270
Asp His Arg Thr Gln Val Phe Tyr Ile Gly Thr Asn Asp Pro Asp Glu
275 280 285
Leu Glu Asp Ile Arg Arg His Ile Leu Ser Gln Phe Lys Val Leu Pro
290 295 300
Val Ala Gly Glu Tyr Met His Arg Ser Tyr Tyr Lys Met Ala Glu Val
305 310 315 320
Tyr Gly Lys Asp Thr Phe Leu Ile Ile Asp Lys Leu Gly Thr Asp Lys
325 330 335
Met Pro Ala Leu Phe Ala Ile Lys Gly Arg Val Asp Ala Val Leu Asn
340 345 350
Lys Val Pro Phe Leu Pro Lys Asn Leu Thr Asp Arg Thr Met Gln Leu
355 360 365
Met Ser Lys Leu Trp Pro Ala His Leu Pro Ala Arg Met Thr Glu Tyr
370 375 380
Arg Asp Lys Tyr Glu His His Leu Met Leu Arg Met Ala Asp Ser Gly
385 390 395 400
Ile Glu Glu Ala Ser Thr Tyr Leu Lys Glu Tyr Phe Lys His Ala Thr
405 410 415
Gly Asp Tyr Phe Glu Cys Thr Glu Glu Glu Gly Asn Lys Ala Phe Leu
420 425 430
His Arg Phe Ala Ala Ala Gly Ala Ala Val Arg Tyr His Ala Val His
435 440 445
Ile Asn Asp Val Glu Asp Val Leu Pro Leu Asp Ile Ala Leu Arg Arg
450 455 460
Asn Asp Arg Asp Trp Phe Glu Lys Leu Pro Pro Glu Ile Glu Asn Gln
465 470 475 480
Leu Leu Tyr Lys Leu Tyr Cys Gly His Phe Met Cys His Val Met His
485 490 495
Gln Asp Tyr Ile Ile Lys Lys Gly Val Asp Ala Lys Ala Leu Lys Ala
500 505 510
Gln Met Leu Ala Leu Leu Asp Lys Arg Gly Ala Glu Tyr Pro Ala Glu
515 520 525
His Asn Val Gly His Leu Tyr Tyr Ala Lys Pro Gln Leu Lys Ala Phe
530 535 540
Tyr Lys His Asn Asp Pro Thr Asn Ser Met Asn Pro Gly Ile Gly Lys
545 550 555 560
Thr Ser Lys Leu Lys Tyr Trp Gly Glu Glu Cys Gly Cys Gly His Asn
565 570 575
His Asn Gln Ala Glu Val Asn His Ile Glu Asn Lys Glu
580 585