一种增强zwf基因启动子表达强度的方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过添加甜菜碱增强6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因zwf启动子表达强度的方法。

背景技术：
：

启动子为RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度，就像“开关”，决定基因的活动。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的这种蛋白质结合而控制基因活动的。启动子位于结构基因5'端上游的一段DNA序列，能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。

目前常用的启动子类型有组成型启动子(能够使基因在所有细胞中都能启动表达的启动子)和诱导型启动子(在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平)。组成型启动子的调控不受外界条件的影响，所启动基因的表达具有持续性，但不表现时空特异性；而诱导型启动子可以通过外界的物理化学信号人为的调控结构基因的表达。

现有技术中的组成型启动子，表达强度不具有时空特异性，不可以人为的调控，在实际应用中不具备可操作性；而诱导型启动子中添加IPTG、乳糖等外源物质，其成本较高，并且对菌体本身有一定的副作用；温度诱导启动子则对温度较为敏感，对设备要求较高，增加能源的消耗。

如专利CN101148679A公开了一种同时受外源IPTG和O₂浓度调控的表达载体，该发明可以用于利用类球红细菌研究光合细菌中各种光合系统基因的表达以及在类球红细菌表达系统中人为调控外源蛋白的表达和纯化提供了有效的工具；专利CN102978232A、CN101914603A和CN104357423A分别公开了一种利用IPTG、乳糖或D-乳糖醇实现重组蛋白高效诱导表达的方法；专利CN102952817A提供了一种采用温度诱导生产外源蛋白的方法，通过控制外界温度实现对结构基因表达的调控；专利CN102978209A提供了一种可以在大肠杆菌中表达目的蛋白的组成型启动子。

本发明的目的在于改进现有的启动子调控技术，提供一种通过外源添加甜菜碱来增强zwf启动子表达强度的方法。可以将其应用于氨基酸等发酵产品中，以及其它需要增强表达强度的基因。本发明可以为以后氨基酸等发酵产品菌株的育种提供参考。

随着生命科学和医学研究的不断深入，研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因。现有的报告基因主要有：分泌型胎盘磷酸酯酶(SEAP)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖苷酸酶(GUS)、萤火虫荧光素酶(LUC)等，但这些基因的检测方法并不理想，它们都需要底物和辅助因子，因而在活体中的应用受到限制。最近，一种全新的非酶性报告基因—绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)引起了人们的关注，该蛋白能够通过翻译后自催化环化产生荧光。作为报告基因，GFP是目前唯一能在活细胞中表达的发光蛋白而且除了氧分子外不需要其他任何底物或辅因子；作为荧光标记分子，GFP既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害，因而被广泛应用于生命研究领域。本发明采用GFP作为报告基因，用以快速验证启动子的表达强度。

大肠杆菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH,编码基因为zwf)是磷酸戊糖途径(PPP)途径中的关键酶，而PPP是合成还原力NADPH的主要途径，很多氨基酸的合成都依赖于NADPH，通过提高zwf基因启动子的强度加强G6PDH的活力从而增加PPP途径的代谢通量来供应NADPH是提高氨基酸合成的一种途径。

本发明旨在通过添加甜菜碱增强zwf启动子的表达强度，提高G6PDH的活力，增加PPP途径的代谢通量提供更多的NADPH，并将该方法推广应用于各种氨基酸、有机酸等发酵产品的生产过程中。

技术实现要素：
：

为了达到上述目的，本发明提供一种增强zwf基因启动子表达强度的方法，所述方法是通过在含有zwf基因启动子的微生物表达体系或发酵体系中添加甜菜碱实现zwf基因启动子表达强度增强0.2-0.98倍；

添加方式为一次性添加或者流加；

所述甜菜碱的添加浓度为0.5-1.0g/L；

所述流加甜菜碱的方式为：初始阶段，培养基中不添加甜菜碱，在目的产物生产进入高峰期时添加60％，其余部分在目的产物生产高峰期阶段分2-3次等时等量添加；

有益效果：

1、本发明通过在表达体系或发酵体系中添加甜菜碱实现zwf启动子表达强度增强的目的，从而提高G6PDH的活力，具有成本低，且简便易行的特点，在添加量1g/L的条件下，即可达到zwf启动子表达强度增强0.98倍的效果；

2、本发明提供的通过外源添加甜菜碱来增强zwf启动子表达强度的方法，可以将其应用于氨基酸等发酵产品中，以及其它需要增强表达强度的基因，为以后氨基酸等发酵产品菌株的育种提供参考。

附图说明：

图1质粒pUC19L-P_zwf–gfp构建流程图；

图2 E.coli DH5αpUC19L-P_zwf-gfp菌株构建各阶段PCR验证图

其中，M为DNA marker；

A中泳道1为反向PCR扩增pUC19-L片段(2252bp)；

B中泳道2为PCR扩增P_zwf片段(485bp)；

C中泳道3为PCR扩增gfp片段(720bp)；

D中泳道4为重叠PCR扩增P_zwf-gfp片段(1205bp)；

E中泳道5为PCR鉴定阳性菌株(2208bp)；

图3不同浓度甜菜碱对单位菌体荧光强度的影响；

图4不同浓度甜菜碱对G6PDH的酶活力；

图5甜菜碱的对菌体生物量的影响；

图6甜菜碱对THRD的G6PDH活性的影响；

图7甜菜碱添加方式对酶活的影响。

具体实施方式：

实施例1：包含zwf基因启动子和绿色荧光蛋白表达基因gfp的重组载体的构建(1)载体pUC19的改造

对载体pUC19进行改造，通过设计反向扩增引物pUC19-F/pUC19-R用以去除其整个Lac操纵子(PCR验证图如图2-A)，改造后的载体片段命名为pUC19-L(SEQ ID No.1)，具体构建流程如图1所示；

(2)zwf基因启动子和gfp基因的扩增及重叠片段的构建

以大肠杆菌E.coli MG1655基因组中的zwf启动子序列(SEQ ID No.2)为模版设计扩增引物P_zwf–up和P_zwf-down；以gfp(SEQ ID No.3)基因序列为模版设计扩增引物gfp–up和gfp–down，引物P_zwf–down与gfp–up中间含有20bp的重叠序列，引物P_zwf–up与gfp–down的5’端各含有与载体待克隆位置上下游的同源序列。

使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase分别扩增zwf基因启动子P_zwf和gfp基因，电泳验证得到目的条带(见图2-B，2-C)，使用广州飞扬生物工程有限公司的OMEGA的PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行回收得到P_zwf和gfp片段；

PCR体系如下：

再通过PrimeSTAR HS DNA Polymerase酶对P_zwf片段和gfp片段进行重叠PCR扩增，电泳验证得到目的条带(见图2-D)，使用试剂盒进行回收得到P_zwf-gfp待用；

PCR体系如下：

(3)构建载体pUC19L-P_zwf-gfp

使用ClonExpress-II One Step Cloning Kit试剂盒将载体pUC19-L与重叠片段P_zwf-gfp进行重组连接；

重组连接体系如下：

(4)重组连接产物转化：

①将重组连接产物37℃水浴30min后冰浴5min，加入至E.coli DH5α感受

态中，用移液器混匀，继续冰浴20min；

②将EP管放置于42℃水浴锅中，热激60s；

③冰浴2min，加入800μL SOC复苏液，37℃，200rpm孵育1h；

④8000rpm离心2min，留100μL液体，重悬菌体，涂布于含有氨苄青霉素

抗性的LB平板中，37℃培养过夜。

(5)阳性克隆子的验证：

菌落PCR体系如下：

在超净台中使用镊子夹住牙签，将牙签下方的尖端迅速穿过火焰2～3次，在长有单菌落的平板上用牙签尖端精确的挑取一个单菌落，首先在已经划好格子线的平板中轻轻划一道，再将牙签放入到与之对应的PCR管中涮洗几次。电泳验证，得到阳性菌株(见图2-E，由于鉴定引物在质粒上，所以PCR扩增得到的条带比目的条带要大)，将平板中正确编号的菌株接入至LB摇管中，37℃培养过夜，甘油管保藏于-80℃中，命名为E.coli DH5αpUC19L-P_zwf-gfp。

实施例2荧光检测及G6PDH的酶活力测定

(1)从甘油管中吸取20μL的E.coli DH5αpUC19L-P_zwf-gfp菌液至含氨苄青霉素抗性的5mL LB摇管中，37℃，200rpm培养12h；

(2)从5mL摇管中按0.1％的接种量转接至30mL的LB培养基中，37℃，200rpm培养8h；

(3)按2％的接种量接种至50mL的LB培养基中(实验组中分别添加终浓度为0.05、0.1、0.5、0.75、1g/L甜菜碱；对照组中不添加甜菜碱)，37℃，200rpm培养，分别取6、9、12h的样品测定OD₆₀₀；

(4)使用日本Hitachi公司的F-7000型荧光分光光度计测量样品的GFP的荧光值。设定激发波长为491nm，发射波长为511nm；

结果见下表及图3，可知甜菜碱的添加能够增强P_zwf的表达，且在1g/L浓度范围内，随着甜菜碱添加浓度的增加，P_zwf表达强度呈提高趋势；

(5)取甜菜碱添加量为0.5、1g/L，12h的样品测定G6PDH的活力；

G6PDH的酶活力按照苏州科铭生物技术有限公司的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)试剂盒进行操作，结果见图4，由图可知，甜菜碱的添加能够能够提高菌体的G6PDH酶活；

(6)测定添加甜菜碱的培养体系对菌体生物量的影响，结果见图5，可知添加甜菜碱对于菌体的生长(OD₆₀₀)有一定的影响，高浓度的抑制作用比较明显，综合图3中甜菜碱对P_zwf表达量的影响，确定在表达或发酵体系中甜菜碱的添加量为0.5-1g/L，可在目的产物生产高峰期通过流加的方式补充甜菜碱，这样既可以降低甜菜碱对菌体生长的影响，同时可以达到提高P_zwf表达强度的效果。

实施例3甜菜碱对苏氨酸生产菌THRD的G6PDH活性的影响

THRD是一株基因组中包含zwf基因的生产苏氨酸的大肠杆菌，采用THRD作为实验菌株，测定甜菜碱对其G6PDH酶活影响，实验过程如下：

(1)用接种环从甘油管中取一环苏氨酸生产菌-E.coli THRD(THRD保藏号CGMCC No.11074)菌液至活化斜面培养基中，进行密布划线，37℃培养8h(一代斜面)；

(2)从一代斜面中取一环菌密布划线于另外一只斜面中，37℃培养8h(二代斜面)；

(3)从二代斜面中取一环菌转接至50mL的种子培养基中，37℃，200rpm培养8h；

(4)按20％的接种量接种至含30mL发酵培养基中(实验组中添加终浓度为0.5g/L甜菜碱；对照组中不添加甜菜碱)，37℃，200rpm培养，用氨水调节pH6.7-7.0，取6、12、18h的样品测定G6PDH的活力；

(5)G6PDH的酶活力按照苏州科铭生物技术有限公司的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)试剂盒进行操作，结果见图6，由图可见0.5g/L甜菜碱在发酵过程中能够将THRD中G6PDH酶活提高至2.7倍左右。

培养基配方：

活化斜面培养基(g/L)：葡萄糖1，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母粉5，NaCl2.5，琼脂条20，调节pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。

种子培养基(g/L)：蔗糖25，酵母粉10，蛋白胨6，KH₂PO₄1.2，MgSO₄·7H₂O0.5，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，VB₁ 1.3mg/L，VH 0.3mg/L，调节pH 7.0-7.2，消泡剂1-2滴，115℃灭菌15min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉2，蛋白胨4，柠檬酸钠1，KH₂PO₄2，MgSO₄·7H₂O 0.7，FeSO₄·7H₂O 100mg/L，MnSO₄·H₂O 100mg/L，VB₁ 0.8mg/L，VH 0.2mg/L，苯酚红2ml/100ml，调节pH 7.0-7.2，消泡剂1-2滴，115℃灭菌15min。

实施例4甜菜碱添加方式对zwf启动子的影响

(1)将实施例1中构建的载体pUC19-P_zwf-gfp转化至E.coli THRD中，构建THRD pUC19L-P_zwf–gfp菌株；

(2)用接种环从甘油管中取一环THRD pUC19L-P_zwf-gfp菌液至含有氨苄青霉素抗性的活化斜面培养基中，进行密布划线，37℃培养12h(一代斜面)；

(3)从一代斜面中取一环菌密布划线于另外一只斜面中，37℃培养8h(二代斜面)；

(4)从二代斜面中取一环菌转接至50mL的种子培养基中，37℃，200rpm培养8h，各培养基均同实施例3；

(5)按20％的接种量接种至含30mL发酵培养基中，37℃，200rpm培养，用氨水调节pH6.7-7.0，实验分为3组，1组不添加甜菜碱，2组培养基中添加终浓度1g/L甜菜碱，3组培养基中开始不添加甜菜碱，发酵过程中流加甜菜碱，流加过程如下：将甜菜碱配制成高浓度母液(溶解于去离子水中，115℃高温灭菌10min)，其浓度为60g/L，菌体产酸高峰期(14h-22h)，其中在14h一次性添加0.3mL的甜菜碱母液，以后每4h添加0.1mL(18h和22h各添加一次)，分别取16、20、24h的样品测定荧光值(添加时间与取样测定时间不一致，目的是让甜菜碱在发酵体系中先发挥一定作用)。

实验结果见图7，由图可知，发酵体系中添加相同浓度甜菜碱的情况下，流加方式对于启动子的增强效果优于一次性添加，且在添加一段时间后效果较明显，24h时一次性添加1g/L的甜菜碱是不添加甜菜碱时zwf启动子表达强度的1.36倍，流加1g/L的甜菜碱是不添加甜菜碱时zwf启动子表达强度1.98倍。

(注：实验组2中添加了1g/L的甜菜碱，体积为30mL，所以添加的甜菜碱总量为1mg/mL*30mL＝30mg；由于添加进入培养基中的甜菜碱为高浓度母液，其所带来的体积变化很小，可以忽略不计；在实验组3中，甜菜碱的添加总量为：60mg/mL*0.5mL＝30mg)。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种增强zwf基因启动子表达强度的方法

<130> 1

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2252

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag 180

gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 240

cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 300

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gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc 480

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accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1800

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1860

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 1920

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<212> DNA

<213> MG1655

<400> 2

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ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

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gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

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<212> DNA

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