新型玉米泛素启动子的制作方法

新型玉米泛素启动子的制作方法
【专利摘要】玉米栽培种B73泛素?1(玉米栽培种B73 Ubi?1)启动子在植物中驱动组成型转基因的高水平表达。在多基因构建体中反复使用相同的玉米栽培种B73 Ubi?1启动子还会导致基因沉默，从而使转基因产物有效性降低。提供了基因调控启动子元件、构建体，和使用来自不同玉米基因型玉米栽培种Hi?II的Ubi?1启动子的基因调节元件在植物细胞和/或植物组织中表达转基因的方法。
【专利说明】新型玉米泛素启动子
[0001] 相关专利申请相互参考
[0002] 本申请要求根据35 US巧119(e)获得于2013年12月31日提交的美国临时专利申请 系列号61/922，526的利益，其全部公开内容通过提述并入本文。
[0003] 援引电子提交的序列表
[0004] 序列表的正式拷贝已作为ASCII格式序列表通过EFS-Web电子提交，文件名为 "75664_ST25.txt"，创建于2014年12月30日，大小为11.4千字节，并与本说明书同时提交。 该ASCII格式文档中包含的序列表是本说明书的一部分，并且其全部内容通过提述并入本 文。 发明领域
[0005] 本发明一般地设及植物分子生物学领域，更具体地，设及在植物中表达转基因的 领域。
[0006] 背景
[0007]许多植物物种能够被转基因转化，W引入农艺学期望的性状或特征。开发和/或修 饰植物物种使之具有特定的期望性状。一般地，期望的性状包括，例如，提高营养价值品质、 增加产量、赋予病虫害抗性、提高干旱和胁迫耐受性、提高园艺品质（例如，色素沉着和生 长）、赋予除草剂抗性、能够从植物生产工业上有用的化合物和/或材料，和/或赋予生产药 物的能力。
[000引通过植物转化技术产生在单个基因组座位上堆叠多个转基因的转基因植物物种。 植物转化技术将转基因引入到植物细胞中，回收在植物基因组中稳定整合了转基因拷贝的 能育的转基因植物，随后通过转基因的转录和翻译进行转基因表达，从而产生具有期望性 状和表型的转基因植物。不过，能够产生高表达W性状堆叠的形式工程构建的多个转基因 的转基因植物物种的办法是令人期望的。
[0009] 类似地，能够在植物的特定组织或器官中表达转基因的办法也是令人期望的。例 如，通过用病原体抗性基因转化植物基因组从而使病原体抗性蛋白在植物的根部强烈表 达，可能实现植物对±壤源性病原体感染的抗性提高。或者，可能期望在处于特定生长或发 育阶段，例如细胞分裂或伸长期，的植物组织中表达转基因。
[0010] 本文描述了玉米化i-1启动子调节元件，其包括启动子、上游启动子、5'-UTR和内 含子。进一步描述了使用该基因调节元件的构建体和方法。
[00川概要
[0012] 本文公开了用于在植物细胞和/或植物组织中表达转基因的启动子、构建体和方 法。在一个实施方案中，转基因的表达包括使用启动子。在一个实施方案中，启动子包含多 核巧酸序列。在一个实施方案中，启动子多核巧酸序列包含上游启动子，5'-非翻译区（5'- UTR)或前导序列，和内含子。在一个实施方案中，启动子多核巧酸序列包含泛素-1基因 化bi-1)。在一个实施方案中，启动子多核巧酸序列包含玉米(Z.mays)的化i-1基因。
[0013] 在一个实施方案中，构建体包括基因表达盒，所述基因表达盒包含从玉米化i-1基 因获得的启动子多核巧酸序列。在一个实施方案中，来自玉米的化i-1启动子多核巧酸序列 包括上游启动子区，5'-UTR或前导序列，和内含子。在一个实施方案中，构建体包括基因表 达盒，所述基因表达盒包含从玉米化i-1基因获得的启动子多核巧酸序列，该启动子多核巧 酸序列与来自杯水母属(PMalidium)物种的黄色巧光蛋白编码基因（PMYFP)的内含子融 合。在一个实施方案中，构建体包括基因表达盒，该基因表达盒包含来自玉米化i-1基因的 启动子多核巧酸序列，所述启动子多核巧酸序列与来自杯水母属物种的黄色巧光蛋白编码 基因（PMYFP)的内含子融合，随后是来自玉米过氧化物酶5基因（ZmPer5)的3'-非翻译区 (3'-UTR)。所得的多核巧酸序列包括新的启动子基因调控元件。
[0014] 在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因或异源编码序列可操作连接的基因 启动子调节元件。在一个实施方案中，基因表达盒包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更 多个转基因。
[0015] 本文公开了培植植物的方法，所述植物使用新型基因启动子调节元件(例如，上游 启动子，5'-UTR和内含子)表达转基因。本文还公开了培养植物组织和细胞的方法，所述植 物组织和细胞使用新的基因启动子调节元件表达转基因。在一个实施方案中，本文公开的 方法包括植物叶、根、愈伤组织和花粉中的组成型基因表达。本文还公开了纯化包含新的基 因启动子调节元件的多核巧酸序列的方法。
[0016] 附图简述
[0017]图1显示构成玉米栽培种B73化i-1基因的示意性的新型启动子。该启动子包括上 游元件、5'-UTR或前导序列，和内含子。该上游元件位于转录起始位点（TSS)的5'上游，用长 箭头指示。该上游元件由调节元件（例如TATA盒，用短箭头指示）和热休克元件（用星号指 示)构成。
[0018]图2显示了载体PDAB105713的质粒图，其包括PCR扩增的玉米栽培种化-II Ubi-1 基因的启动子序列。
[0019] 图3显示了玉米栽培种B73 Ubi-1基因对照启动子（SEQ ID N0:1)的多核巧酸序 列，上游启动子区用下划线指示，5'-UTR/前导序列用阴影指示，内含子区用小写字母指示。
[0020] 图4显示了玉米栽培种化-II Ubi-1启动子(SEQ ID N0:2)的多核巧酸序列，上游 启动子区用下划线指示，5'-UTR/前导序列用阴影指示，内含子区用小写字母指示。
[0021] 图5显示了玉米栽培种化-II的上游启动子区（SEQ ID NO:4)与玉米栽培种B73的 对照上游启动子序列(SEQ ID N0:3)的多核巧酸序列比对。
[0022] 图6显示了玉米栽培种化-n的5'-UTR/前导区（SEQ ID N0:6)与玉米栽培种B73的 对照5'-UTR/前导序列（SEQ ID N0:5)的多核巧酸序列比对。
[0023] 图7显示了玉米栽培种化-II的内含子区（SEQ ID NO:8)与玉米栽培种B73的对照 内含子序列(SEQ ID NO:7)的多核巧酸序列比对。
[0024] 图8显示了二元表达构建体PDAB105748的载体图，其包括插入在目的载体 pDABl0197中的对照入口载体pDABl05742(玉米栽培种B73)。
[002引图9显示了二元表达构建体PDAB105746的载体图，其包括插入在目的载体 PDAB10197中的入口载体pDAB105740(玉米栽培种Hi-II)。
[0026] 详细说明
[0027] 定义
[002引如本文所使用的，除非在上下文中清晰且明确地指出，否则冠词"一"、"一个"和 "该"包括复数指代。
[0029] 如本文所使用的，术语"回交"是指如下的过程，其中育种者将杂交后代与其中一 个亲本杂交，例如第一代杂交体F1与F1杂交体的亲本基因型的其中一个杂交。
[0030] 如本文所使用的，术语"内含子"是指基因（或者被表达的感兴趣核巧酸序列）中包 含的任何被转录但不被翻译的核酸序列。内含子包括被表达的DNA序列内的非翻译核酸序 列，W及从其转录的RNA分子中的相应序列。
[0031] 本文所述的构建体还可W包含可增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，例如内含子。 运样的一个内含子的实例是拟南芥组蛋白H3变异体基因 II的第一内含子，或者任何其它公 知的内含子序列。内含子可W和启动子序列组合使用，W提高翻译和/或mRNA稳定性。
[0032] 如本文所使用的，术语"5 '非翻译区"或"5 ' -UTR"是指前mRNA或成熟mRNA 5 '端的 非翻译区段。例如，在成熟的mRNA上，5'-UTR通常在其5'端有一个7-甲基鸟巧帽，并且参与 许多过程，例如剪接、多酷巧酸化、mRNA外排到细胞质、mRNA的5 '端被翻译机构识别，和保护 mRNA免于降解。
[0033] 如本文所使用的，术语"3 '非翻译区"或"3 ' -UTR"是指前mRNA或成熟mRNA 53 '端的 非翻译区段。例如，在成熟的mRNA上，运个区域具有多-(A)尾己，并且已知在mRNA稳定性、翻 译起始和mRNA外转运中具有多种功能。
[0034] 如本文所使用的，术语"多腺巧酸化信号"是指mRNA转录本中存在的核酸序列，其 在多-(A)聚合酶存在时允许转录本的多酷巧酸化位点（例如位于多-(A)信号下游10-30个 碱基）多酷巧酸化。许多多酷巧酸化信号是本领域已知的，并可用于本发明。一个示例性序 列包括AAUAAA及其变异体，如Loke J.，et al.，（2005)Plant Physiology 138(3); 1457- 1468所述。
[0035] 如本文所使用的，术语"分离的"是指与该组分自然存在的生物体细胞中的其它生 物组分（即，其它染色质和染色质外DNA)分离的生物组分(包括核酸或蛋白质）。
[0036] 如本文所使用的，在指示核酸分子时，术语"纯化的"不需要绝对的纯(例如，同质 的制备物）。相反，它表示该序列比其在天然的细胞环境中相对更纯。例如，核酸的"纯化"水 平在浓度或基因表达水平上应当比自然水平大至少2-5倍。
[0037] 请求保护的DNA分子可W从总DNA或总RNA中直接分离。此外，cDNA克隆不是自然存 在的，但优选地通过对部分纯化的、天然存在的物质（信使RNA)进行操作而得。从mRNA构建 cDNA文库设及创制合成的物质（cDNA)。单个cDNA克隆能够通过对携带cDNA文库的细胞进行 克隆选择而从合成文库中纯化。因此，包括从mRNA构建cDNA文库和纯化不同cDNA克隆的过 程会产出纯化大约1〇6倍的天然信息。类似地，启动子DNA序列可W被克隆到质粒中。运种质 粒不是天然存在的，而是优选地通过对部分纯化的、天然存在的物质例如基因组DNA文库进 行操作而获得的。因此，在运些技术中，优选地使纯化放大至少1个数量级，在一些实施方案 中，放大2个或3个数量级，在其它实施方案中，放大4个或5个或更多个数量级。
[003引类似地，纯化表示组分DNA序列发生了化学或功能上的改变。"被纯化"的核酸分子 和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。术语"纯化的"还包括通过重组 DNA方法在宿主细胞(例如植物细胞）中制备的核酸和蛋白质，W及化学合成的核酸分子、蛋 白质和肤。
[0039] 术语"重组的"意思是其中发生了遗传重组的细胞或生物体。它还包括通过人为干 预被人工或合成（即非自然的）改变的分子(例如，载体、质粒、核酸、多肤或小RNA)。对分子 进行改变可W在其自然环境或状态下执行或者从其自然环境或状态下移除。
[0040] 如本文所使用的，术语"表达"是指多核巧酸被转录成mRNA(包括小RNA分子）的过 程，和/或被转录的mRNA(也称作"转录本"）被随后翻译成肤、多肤或蛋白质的过程。基因表 达可能受到外部信号的影响，例如细胞、组织或生物体暴露于可增加或降低基因表达的试 剂。基因的表达还可W在从DNA到RNA到蛋白质的通路的任何位置被调节。基因表达的调节 通过例如控制转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子如mRNA的降解，或者通过在特定蛋白质 分子被制造出后使它们激活、失活、区室化或降解，或者通过它们的组合，而发生。基因表达 可W在RNA水平或蛋白质水平通过本领域已知的任何方法进行测量，包括但不仅限于， No;rthe;rn印迹、RT-PCR、Weste;rn印迹、或者体外、原位或体内蛋白活性测定。
[0041 ]如本文所使用的，术语"基于同源性的基因沉默"或"HBGS"是通用术语，其包括转 录基因沉默和转录后基因沉默。祀基因座被非连锁的沉默基因座沉默可W由转录抑制(转 录基因沉默;TGS)或mRNA降解(转录后基因沉默;PTGS)导致，它们分别是由于产生了相应于 启动子或转录序列的双链RNA(dsRNA)。每个过程设及不同的细胞组分，运表明dsRNA诱导的 TGS和PTGS很可能来自于一个共同的古老机制的多样化。然而，难W进行对TGS和PTGS的严 格比较，因为运一般依赖于对不同沉默基因座的分析。单个转基因座位可W被描述为可触 发TGS和PTGS二者，因为它会产生相应于不同祀基因的启动子和被转录序列的dsRNA。
[0042] 如本文所使用的，术语"核酸分子"、"核酸"或"多核巧酸"（所有运S个术语彼此之 间是同义的）是指多聚体形式的核巧酸，其可W包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义和反义链， 及其合成形式和混合聚合物。"核巧酸"可W指核糖核巧酸、脱氧核糖核巧酸或或任一种核 巧酸的修饰形式。除非另外指出，否则核酸分子的长度通常为至少10个碱基。该术语可W指 不定长度的RNA或DNA分子。该术语包括单链和双链形式的DNA。核酸分子可W包括天然存在 的和/或经过修饰的核巧酸，藉由天然存在的和/或非天然存在的核巧酸键连而连接在一 起。
[0043] 核酸分子可W被化学修饰或者生物化学修饰，或者可W包含非天然的或衍生化的 核巧酸碱基，运是本领域技术人员可W容易理解的。运些修饰包括，例如，标签、甲基化、一 个或多个天然发生的核巧酸用类似物取代、核巧酸内部修饰(例如不带电的连接:例如，甲 基麟酸醋，憐酸=醋，憐酷胺，氨基甲酸醋等;带电荷的连接:例如，硫代憐酸醋，二硫代憐酸 醋等;悬垂部分:例如，肤;嵌入剂:例如，叮晚，补骨脂素等;馨合剂;烧化剂;和修饰的键:例 如，a异头核酸等）。术语"核酸分子"还包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链体、= 链体(triplexed)，发针式化airpinned)，圆形和挂锁构象。
[0044] 转录沿着DNA链沿着5'-3'的方式前进。运意味着，RNA的制备是通过向生长链的3' 端顺次添加核糖核巧酸-5'-=憐酸(要求清除焦憐酸）。在线性或环状核酸分子中，如果离 散的元件（例如，特定的核巧酸序列）键合或者将要键合于相同核酸上的其他元件的5'方 向，则其被称作位于该其他元件的"上游"。类似地，如果离散的元件键合或者将要键合于相 同核酸上的其他元件的3'方向，则其被称作位于该其他元件的"下游"。
[0045] 如本文所使用的，术语"碱基位置"是指给定碱基或核巧酸残基在指定核酸内的位 置。指定的核酸可W通过与参考核酸进行比对加 W定义。
[0046] 如本文所使用的，术语"杂交"是指多核巧酸或寡核巧酸和它们的类似物通过互补 碱基之间的氨键键合而杂交的过程，氨键包括巧曰13011-吐；[。4、化0旨3166]1或反向化0旨3166]1 氨键。一般地，核酸分子包括含氮碱基，含氮碱基是喀晚(胞喀晚(C)，尿喀晚化)和胸腺喀晚 (T))或者嚷岭（腺嚷岭(A)和鸟嚷岭(G))。运些含氮碱基在喀晚与嚷岭之间形成氨键，喀晚 与嚷岭的键合称作"碱基配对"。更具体地，A与T或U氨键键合，G与C键合。巧补"是指两个不 同核酸序列或同一核酸序列的两个不同区域之间发生的碱基配对。
[0047] 如本文所使用的，术语"可特异性杂交"或"特异性互补"是指足够程度的互补性， 使得在寡核巧酸/多核巧酸和DNA或RNA祀之间发生稳定而特异的结合。寡核巧酸/多核巧酸 不需要与祀序列100%互补才能特异性杂交。当寡核巧酸/多核巧酸与祀DNA或RNA分子的结 合会干扰祀DNA或RNA的正常功能，并且存在足够程度的互补性W避免寡核巧酸/多核巧酸 在特异性结合所期望的条件下（例如在体内测定或系统的生理条件下）与非祀序列发生非 特异性结合时，寡核巧酸/多核巧酸是可特异性杂交的。运种结合被称作特异性杂交。导致 特定严格程度的杂交条件随着所选杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和长度而改变。 一般地，杂交溫度和杂交缓冲液的离子强度(特别是化+和/或Mgh浓度)对杂交严格度有贡 献，但清洗次数也会影响严格度。关于获得特定严格程度所需的杂交条件的计算在 Sambrooket al. (ed.) .Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2片反，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York, 1989中有讨论。
[0048] 如本文所使用的，术语"严格条件"包括如下条件，其中只有当杂交分子和DM祀之 间的错配小于50 %时才会发生杂交。"严格条件"包括进一步特定水平的严格性。因此，如本 文所使用的，"中等严格"条件是指序列错配超过50%的分子不会杂交的条件；"高严格"条 件是指序列错配超过20 %的序列不会杂交的条件；和"极高严格"条件是指序列错配超过 10%的序列不会杂交的条件。在特定的实施方案中，严格条件可W包括在65°C杂交，随后在 65°C用0. lx SSC/0.1 %SDS清洗40分钟。下面是代表性的、非限制性的杂交条件：
[0049] ?极高严格性:在5x SSC缓冲液中65°C杂交16个小时；在2x SSC缓冲液中室溫下 清洗2次，每次15分钟;和在0.5x SSC缓冲液中65 °C清洗2次，每次20分钟。
[0化0] ?高严格性:在5-6x SSC缓冲液中65-70°C杂交16-20个小时；在2x SSC缓冲液中 室溫下清洗2次，每次5-20分钟;和在lx SSC缓冲液中55-70°C清洗2次，每次30分钟。
[0化1] ?中等严格性:在6x SSC缓冲液中在室溫-55°C杂交16-20个小时；在2-3x SSC缓 冲液中室溫下清洗至少2次，每次20-30分钟。
[0052] 在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能够在极高严格性杂交条件下保持 结合。在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能够在高严格性杂交条件下保持结合。 在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能够在中等严格性杂交条件下保持结合。
[0053] 如本文所使用的，术语"寡核巧酸"是指短核酸多聚体。寡核巧酸可W通过切割长 核酸区段或者通过聚合单个核巧酸前体而形成。自动合成仪允许合成长度达数百个碱基对 的寡核巧酸。因为寡核巧酸可W结合互补的核巧酸序列，所W它们被用作检测DNA或RNA的 探针。由DNA构成的寡核巧酸(寡脱氧核糖核巧酸)可W用在聚合酶链式反应中，运是一种用 于扩增小DNA序列的技术。在聚合酶链式反应中，寡核巧酸通常被称作"引物"，其允许DNA聚 合酶延伸寡核巧酸并复制互补链。
[0054] 如本文所使用的，术语"聚合酶链式反应"或"PCR"是指一种微量的核酸、RNA和/或 DM被扩增的程序或技术，其中，如美国专利No. 4，683，195所述。一般地，来自感兴趣区域末 端或超过该末端的序列信息必须可得，才能设计寡核巧酸引物;运些引物在序列上与待扩 增模板的相对链相同或相似。两个引物的5'端核巧酸可W和被扩增材料的末端一致。PCR可 用于扩增特定的RNA序列，从总基因组DNA中扩增特定的DNA序列，和从总细胞RNA、隧菌体或 质粒序列中转录cDNA，等。一般地参见Mul 1 is et al Cold Spring Harbor Symp .Quant .Biol. ,51: 263( 1987) ;E；;rlich编辑，PCR Technology, (Stockton Press ,NY, 1989)。
[0055] 如本文所使用的，术语"引物"是指当条件适合于合成引物延伸产物时，能够作为 沿着互补链的合成起始点的寡核巧酸。合成条件包括四种不同的脱氧核糖核巧酸=憐酸和 至少一种聚合诱导剂例如逆转录酶或DNA聚合酶的存在。它们处于合适的缓冲液中，该缓冲 液包括辅助因子或可W在各种合适的溫度下影响条件(例如抑等）的成分。引物优选地是单 链序列，从而可W使扩增效率最佳，但是也可W使用双链序列。
[0056] 如本文所使用的，术语"探针"是指与祀序列杂交的寡核巧酸或多核巧酸序列。在 TaqMan 1'或TaqMan K类测定程序中，探针与位于两个引物退火位点之间的祀部分杂交。 探针包括大约8个核巧酸，大约10个核巧酸，大约15个核巧酸，大约20个核巧酸，大约30个核 巧酸，大约40个核巧酸，或者大约50个核巧酸。在一些实施方案中，探针包括大约8个核巧 酸-大约15个核巧酸。
[0化7] 在Southern印迹测定程序中，探针与附着在膜上的DNA片段杂交。在运种测定中， 探针包括大约10个核巧酸，大约100个核巧酸，大约250个核巧酸，大约500个核巧酸，大约1， 000个核巧酸，大约2，500个核巧酸，或者大约2，500个核巧酸。
[0058] 探针可W进一步包括可检测的标签，例如放射性标签、生物素化标签、巧光团（ Texas-Red?,异硫氯酸巧光素，等）。可检测的标签可W直接共价连接到探针寡核巧酸上， 例如位于探针的5'端或探针的3'端。包含巧光团的探针还进一步包括泽灭剂（例如Black Hole 如encher?,i〇wa Black?等）。
[0059] 如本文所使用的，术语"序列同一性"或"同一性"可W互换使用，指当通过比对两 个序列W在特定比较窗口上实现最大的相应度时，两个序列中相同的核酸残基。
[0060] 如本文所使用的，术语"百分比序列同一性"是指通过比较在比较窗口上最佳比对 的序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)而确定的数值，其中为了使两个序列实现最佳比对， 一个序列在比较窗口中的部分与参考序列（其不包含添加或缺失)相比，可W包含添加或缺 失（即，缺口）。通过确定两个序列中出现相同核酸或氨基酸残基的位置的数目W产生匹配 位置的数目，用匹配位置的数目除W比较窗口中的位置总数，所得结果乘W100计算出百分 数，从而产生百分比序列同一性。比对序列W供比较的方法是众所周知的。各种程序和比对 算法在下列文献中有描述，例如：Smith and Watermark 1981)AdV. A邮1. Math . 2 : 482 ; Needleman and Wunsch(1970)J.Mo 1. Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988) Proc.化tl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444;Higgins and 化arp(1988)Gene 73:237-44; Higgins and Sha;rp(1989)CABI0S 5:151_3;Corpetet al.(1988)Nucleic Acids Res.16: 10881-90;Huang et al.(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155_65;Pearson et al.(1994) Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana et al.(1999)FEMS Microbiol. Lett.174:247- 50 o
[0061 ] 美国国家生物技术信息中屯、(NCBI)基本局部比对捜索工具(BLAST?;Altschulet al.( 1990) J.Mol. Biol. 215:403-10)可W从多个来源访问，包括美国国家生物技术信息中 屯、(Bethesda，MD)和在互联网上，用于和多种序列分析程序结合使用。关于如何使用该程序 确定序列同一性的描述可W在互联网上在化AST?的"帮助"部分获得。对于核酸序列的比 较，可W使用默认参数执行BLAST?程序的"blast 2序列"功能(Blastn)。当使用运种方法进 行评估时，与参考序列的相似性越大的核酸序列将显示更高的百分比同一性。
[0062] 如本文所使用的，术语"可操作连接"是指核酸被置于与另一个核酸的功能关系 中。一般地，"可操作连接"可W表示被连接的各核酸是邮连的。连接可W通过在方便限制位 点处进行连接作用来实现。如果不存在运些位点，则用合成的寡核巧酸衔接子或结构与核 酸进行连接作用或退火，并用于连接邮连的多核巧酸片段。然而，元件不必是邮连的才能可 操作连接。
[0063] 如本文所使用的，"启动子"是指一段DNA区域，其一般位于基因的上游(朝着基因 的5'区），并且是触发和驱动基因转录所需要的。启动子可W允许它所控制的基因被合适地 激活或抑制。启动子可能含有被转录因子识别的特定序列。运些因子可W结合启动子DNA序 列，导致RNA聚合酶被招募，运种酶从基因的编码区合成RNA。启动子一般指位于基因上游的 全部基因调节元件，包括上游启动子、5'-UTR、内含子和前导序列。
[0064] 如本文所使用的，术语"上游启动子"是指足够指导转录起始的一段邮连的多核巧 酸序列。如本文所使用的，上游启动子包括转录起始位点，其具有多个序列基序，包括TATA 盒、起始子序列（initiator sequence)、TFI IB识别元件（BRE )和其它启动子基序 (Jennifer，E.F.et al.，（ 2002 )Genes&Dev .，16: 2583-2592)。上游启动子提供了RNA 聚合酶 11( 一种多亚基酶)与基础或一般转录因子如TFIIA，B，D，E，F和H的作用位点。运些因子组装 成转录前-起始复合体，后者催化从DNA模板合成RNA。
[0065] 上游启动子的激活是通过加入调节性DNA序列元件，多种蛋白质与调节性DNA序列 元件结合，并随后与转录起始复合体接触从而激活基因表达。运些基因调节元件序列与特 定的DNA结合因子相互作用。运些序列基序有时被称作顺式元件。运些顺式元件与组织特异 性或发育特异性转录因子结合，它们可W单独或者组合地在转录水平上决定启动子的时空 表达模式。运些顺式元件对可操作连接基因的控制类型可能差异很大。一些元件会响应环 境响应(例如溫度、湿度、和致伤)使可操作连接基因的转录增加。其它顺式元件可W响应发 育线索（例如萌发、种子成熟和开花）或者响应空间信息（例如组织特异性）。参见例如 Langridge et al.,(1989)P;roc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3219-23。运些顺势元件的位置与 转录起始点的距离并不相同，一些顺式元件(称作邻近元件)与最小核屯、启动子区域邮邻， 而其它元件可W位于启动子上游或下游数千碱基的位置(增强子）。
[0066] 如本文所使用的，术语"转化"包括所有能够将核酸分子引入到细胞内的技术。实 例包括，但不仅限于：病毒载体转染；质粒载体转化；电穿孔；脂质体转染；显微注射 (Mueller et al.(1978)Cell 15:579-85) ;±壤杆菌介导的转移;直接DNA摄入;WHISKERS? 介导的转化;和微射弹轰击。运些技术可用于植物细胞的稳定转化和瞬时转化二者。"稳定 转化"是指核酸片段引入到宿主生物体的基因组内，导致在遗传上稳定的继承。一旦被稳定 转化，核酸片段便稳定地整合进宿主生物体和任何后代的基因组中。含有转化核酸片段的 宿主生物被称为"转基因"生物。"瞬时转化"是指核酸片段被引入到宿主生物体的细胞核或 含DNA的细胞器中，引起基因表达但不会在遗传上稳定的继承。
[0067] 如本文所使用的，术语"转导"是指病毒将核酸转移到细胞内的过程。
[0068] 如本文所使用的，术语"转基因"是指外源核酸序列。在一个实例中，转基因是基因 序列(例如，除草剂抗性基因），编码工业或制药上有用的化合物的基因，或者编码期望农艺 学性状的基因。在另外的实施例中，转基因是反义核酸序列，其中该反义核酸序列的表达会 抑制祀核酸序列的表达。转基因可W含有与转基因可操作连接的调节序列（例如，启动子、 内含子或3'-UTR)。在一些实施方案中，感兴趣的核酸是转基因。然而，在其它实施方案中， 感兴趣的核酸是内源核酸，其中该内源核酸的额外基因组拷贝是期望的，或者是与宿主生 物体中的祀核酸序列处于反义取向的核酸。
[0069] 如本文所使用的，术语"载体"是指被引入到细胞内从而产生转化细胞的核酸分 子。载体可W包括允许它在宿主细胞内复制的核酸序列，例如复制原点。实例包括，但不仅 限于，质粒、粘粒、隧菌体、细菌人工染色体(BAC)，或可携带外来DNA进入细胞的病毒。载体 还可W包括一个或多个基因、反义分子和/或选择标志物基因和本领域已知的其它遗传元 件。载体可W转导、转化或感染细胞，借此导致细胞表达核酸分子和/或由该载体编码的蛋 白质。载体可W任意地包括帮助核酸分子进入细胞内的材料(例如脂质体）。
[0070] 如本文所使用的，术语"盒子"、"表达盒"和"基因表达盒"是指能够被插入到核酸 或多核巧酸的特定限制位点处或者通过同源重组插入核酸或多核巧酸的DNA区段。DNA区段 包括含有感兴趣基因的多核巧酸，感兴趣基因编码感兴趣的小RNA或多肤，并且该盒子和限 制位点被设计成确保盒子W正确的阅读框被插入，W保证转录和翻译。在一个实施方案中， 表达盒可包括编码感兴趣的小RNA或多肤的多核巧酸，并可具有除该多核巧酸之外的促进 特定宿主细胞的转化的元件。在一个实施方案中，基因表达盒还可W包括如下元件，其允许 在宿主细胞中增强编码感兴趣的小RNA或多肤的多核巧酸的表达。运些元件可W包括，但不 仅限于：启动子，最小启动子，增强子，应答元件，内含子，5'非翻译区序列，3'非翻译区序 列，终止子序列，多腺巧酸化序列，等。
[0071] 如本文所使用的，术语"异源编码序列"用于指示任何编码、或者最终编码肤或蛋 白质或其等价氨基酸序列(例如酶)的多核巧酸，所述肤或蛋白质或其等价氨基酸序列在宿 主生物体中通常不存在，并且在合适的条件下能够在宿主细胞中表达。运样，"异源编码序 列"可W包括一个或多个拷贝的在宿主细胞中通常不存在的编码序列，从而使细胞表达额 外拷贝的在细胞中通常不存在的编码序列。异源编码序列可W是RNA或者其任何类型(例如 mRNA)，DNA或其任何类型（例如cDNA)，或RNA/DNA的杂交体。编码序列的实例包括，但不仅限 于，全长转录单元，其包括例如编码序列、内含子、启动子区、5/-UTR、3/-UTR和增强子区等 特征。
[0072] "异源编码序列"还包括肤或酶的编码部分（即cDNA或mRNA序列），全长转录单元的 编码部分（即包含内含子和外显子的基因），编码酶或者编码其等价氨基酸序列的"密码子 优化"序列、截短的序列和其它具有改变的序列的形式，前提是该等价氨基酸序列可产生功 能性蛋白。运样的等价氨基酸序列可W具有一个或多个氨基酸缺失，该缺失在N端、C端或内 部。也设想了截短的形式，只要它们具有本文所述的催化能力即可。
[0073] 如本文所使用的，术语"对照"是指在分析程序中用于比较目的的样品。对照可W 是"阳性"或"阴性"。例如，当分析程序的目的是检测细胞或组织中差异表达的转录本或多 肤时，一般优选地包含阳性对照，例如来自已知显示期望表达的植物的样品，和阴性对照， 例如来自已知缺少期望表达的植物的样品。
[0074]如本文所使用的，术语"植物"包括植物和植物部分，包括但不仅限于，植物细胞和 植物组织，例如叶、愈伤组织、茎、根、花、花粉和种子。可W在本发明中使用的植物类别宽泛 到包括适合于诱变的高等和低等植物，包括被子植物，裸子植物，藤类植物和多细胞藻类。 因此，"植物"包括双子叶和单子叶植物。双子叶植物的实例包括烟草，拟南芥，大豆，番茄， 木瓜，芥花(canola),向日葵，棉花，首猜，马铃馨，葡萄，木豆，魏豆，芸苔(Brassica)，鹰嘴 豆，甜菜，油菜，西瓜，甜瓜，辣椒，花生，南瓜，萝h渡菜，倭瓜，西兰花，卷屯、菜，胡萝h花挪 菜，芹菜，大白菜，黄瓜，茄子，和窝宦。单子叶植物的实例包括玉米，大米，小麦，甘薦，大麦， 黑麦，高梁，兰花，竹，香蕉，香蒲，百合，燕麦，洋葱，小米和黑小麦。
[007引如本文所使用的，术语"植物部分"是指叶、愈伤组织、茎、根、花或花的部分、果实、 花粉、卵细胞、合子、种子、插条、细胞或组织培养物，或者植物的任何其它部分或产物。在一 个实施方案中，植物材料包括子叶和叶。在一个实施方案中，植物材料包括根组织和其它位 于地下的植物组织。
[0076] 如本文所使用的，术语"选择标志物基因"是指在植物转化中被任选地用于例如保 护植物细胞免于选择剂的伤害或者提供对选择剂的抗性/耐受性的基因。此外，"选择标志 物基因"意图包括报告基因。只有那些接受了功能性的选择标志物的细胞或植物才能够在 具有选择剂的条件下分裂或生长。选择剂的实例可包括，例如，抗生素，包括壮观霉素，新霉 素，卡那霉素，己龙霉素，庆大霉素，和潮霉素。运些选择标志物包括新霉素憐酸转移(npt II)，其表达的酶可赋予对抗生素卡那霉素的抗性，和针对相关抗生素新霉素、己龙霉素、庆 大霉素和G418的基因，或者潮霉素憐酸转移酶化pt)的基因，其表达的酶可赋予对潮霉素的 抗性。其它选择标志物基因可W包括编码除草剂抗性的基因，包括bar或pat(抵抗草锭麟锭 盐或麟丝菌素），乙酷乳酸合酶(ALS，抵抗抑制剂例如横酷脈类(SU)，咪挫嘟酬类（IMI)，S 挫并喀晚(TP)，喀晚氧基苯甲酸(pyrimidinyloxybenzoate)(POB)，和横酷幾基S挫嘟酬， 其可阻止支链氨基酸合成的第一步，草甘麟，2,4-D和金属抗性或敏感性。可W用来作为选 择标志物基因的"报告基因"的实例包括可W视觉观察所表达报告基因的蛋白，例如编码0 葡糖巧酸酶(GUS)、巧光素酶、绿色巧光蛋白（GFP)、黄色巧光蛋白蛋白（YFP)、化RecUe-半乳 糖巧酶、氯霉素乙酷转移酶(CAT)、碱性憐酸酶和类似物的蛋白质。短语"标志物阳性"是指 已经被转化为包含选择标志物基因的植物。
[0077] 如本文所使用的，术语"可检测标志物"是指能够检测的标记，例如放射性同位素， 巧光化合物，生物发光化合物，化学发光化合物，金属馨合剂，或酶。可检测标记物的实例包 括，但不仅限于，下述者：巧光标记(例如，FITC，罗丹明，铜系憐光体），酶标记(例如辣根过 氧化物酶，e半乳糖巧酶，蛋光素酶，碱性憐酸酶），化学发光，生物素基团，可W被第二报告 分子识别的预定多肤表位(例如，亮氨酸拉链对序列，第二抗体的结合位点，金属结合结构 域，附加表位）。在一个实施方案中，可检测标记物可W附加各种长度的间隔臂，W减少潜在 的空间位阻。
[0078] 如本文所使用的，术语"检测"使用其最广泛的含义，包括对特定分子的定性和定 量测量，例如测量特定的多肤。
[0079] 除非另有具体说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域 普通技术人员所公知的相同的含义。分子生物学常用术语的定义可W在列文献中找到，例 如：Lewin,Genes V,Oxford University Press,1994;Kendrew et al.(编辑），^6 Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd., 1994;和Meyers(编辑）， Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference ,VCH Publishers,Inc.,1995。
[0080] 启动子作为基因表达调节元件
[0081] 用于基础研究或生物技术应用的植物启动子一般是单向的，指导融合到其3'端 (下游）的转基因的组成型表达。代谢工程和性状堆叠通常需要在植物体内强表达转基因。 此外，在转基因作物中通常需要多个新启动子来驱动多个基因的表达。本文公开了能够指 导融合在其3'端的转基因的表达的组成型启动子。
[0082] 转基因产品的开发日益复杂，需要强表达转基因并在单个基因座中堆叠多个转基 因。传统上，每个转基因的表达通常需要一个独特的启动子，其中在一个基因堆叠内需要多 个启动子来表达不同的转基因。随着基因堆叠规模的增加，运经常导致为了表达单个多基 因性状而重复使用相同的启动子，W获得不同转基因的相似水平的表达模式。
[0083] 已知受相同启动子驱动的多基因构建体会导致基因沉默，导致转基因产物在大田 中有效的效力降低。由于启动子重复而产生的过多的转录因子(TF)结合位点会导致内源TF 的枯竭，从而使转录失活。转基因沉默很可能对为表达转基因而产生的转基因植物的性能 带来不利影响。转基因内的重复序列会导致基因座位内的同源重组，进而导致多核巧酸重 排。
[0084] 除了组成型启动子，组织特异性或者器官特异性启动子驱动基因在特定的组织 中，如在谷粒、根、叶、愈伤组织、花粉或植物的绒拉层中表达。组织和发育阶段特异的启动 子驱动基因在特定的组织中或者在植物发育过程的特定时间段内表达。组织特异性启动子 对于转基因植物产业的某些应用是需要的，并且是期望的，因为它们允许在不同组织和/或 在选定的发育阶段中特异性地表达异源基因，指示异源基因在各种器官、组织和/或在不同 时间内差异性表达，而非在其他情况下表达。
[0085] 例如，可W通过用病原抗性基因转化植物基因组，使得病原体抗性蛋白在植物中 强烈表达，来实现增强植物对±壤传播的病原体的感染的抵抗力。或者，可能期望在处于特 定生长或发育阶段，例如细胞分裂或伸长期，的植物组织中表达转基因。另一个应用是使用 组织特异性启动子的可取之处，使得启动子能够将编码农艺性状的转基因的表达限制在发 育中的植物部分(即，根，叶，愈伤组织，或花粉)中。
[0086] 本文所述的启动子可望成为制备含有多个基因的商业转基因构建体的工具。运些 启动子还提供了在细菌宿主内的结构稳定性和在植物细胞中的功能稳定性，例如减少转基 因沉默，从而为转基因表达创造条件。具有不同表达范围的启动子，也可W通过使用本文所 述的方法获得。相比于多次使用单个启动子的转基因构建体，本申请中描述的多样化启动 子构建体更加适合转基因事件的下游分子分析。使用本文描述的多样化启动子还可W减少 在用锋指技术进行祀定过程中转基因多基因座位的重排(SHUKLA等人.2009)。
[0087] 玉米泛素-1启动子
[0088] 玉米师i-1启动子已经成为生物技术产业的标准手段，主要用于在玉米中稳定高 表达转基因 （CHRISTENSEN and QUAIL 1996;CHRISTENSEN et al.l992;T0KI et al. 1992)。每个转基因的充分表达通常需要一个特定的启动子。在一个基因堆叠中通常需 要多个启动子来表达不同的转基因。运种范式经常导致重复使用玉米化i-1启动子，因为它 有令人期望的高水平蛋白质表达和组成型表达模式。
[0089] 然而，在转基因座位内故意引入重复的序列也会对转基因的表达和稳定性产生不 期望的负面影响（FLADUNG and KUMAR 2002;KUMAR and FLADUNG 2000a;KUMAR and FLADUNG 2000b；KUMAR and FLADUNG 200la；KUMAR and FLADUNG 2001b；KUMAR and 化ADUNG 2002;METTE et al.l999;M0URRAIN et al.2007)。多个转基因协调表达运一挑战 可W使用启动子多样化方法来解决，其中不同的启动子用于驱动具有相同的表达概貌的不 同转基因 （PEREMARTI et al.2010)。本申请描述了通过从不同玉米基因型中鉴定和纯化新 启动子而获得的多样化化i-1启动子序列。
[0090] 植物基因中基因表达的转录起始和调节受到多个DNA序列元件的指导，运些序列 元件集合排列成一个较大的序列，称为启动子。真核启动子通常由最小核屯、启动子和上游 调节序列构成。核屯、启动子是足W指导转录的准确起始的最小一段连续DNA序列。植物中的 核屯、启动子一般包括与转录起始相关的规范区（canonical region)，例如CAAT和TATA框 (共有序列TATAWAWKTATA框元件通常位于转录起始位点（TSS)上游大约20-35个碱基对 (bp)。核屯、启动子的激活由上游调节序列实现，它们结合各种蛋白质，随后与转录起始复合 体相互作用，从而激活基因表达。运些调节元件包括确定启动子时空表达模式的DNA序列。
[0091] 参考图1，玉米化i-1基因启动子来自于玉米近交细胞系B73。玉米师i-1启动子包 括位于TSS 5'上游的大约89化P的DNA序列（即，上游元件）。此外，玉米师i-1启动子包括位 于TSS 3'下游的大约1093bp的DNA序列（参见美国专利5,510,474)。因此，玉米化1-1启动子 的总DNA序列包括大约2000个碱基对化b)。
[0092] 玉米化i-1启动子的上游元件包括位于TSS 5'上游大约30bp的TATA框（图1和3)。 此外，该上游元件包括位于TSS 5 '直接上游的两个重叠的热休克共有元件。一个82bp的5 '- UTR或前导序列位于TSS的3'直接下游，随后是内含子，其从碱基83延伸到1093(图1和3)。
[0093] W前的工作已经描述了由玉米师i-1启动子调节的基因和/或转基因的基因表达 增加。例如，氯霉素乙酷转移酶(CAT)基因与玉米化i-1启动子的转录融合使得CAT在玉米原 生质体中的活性是由花挪菜花叶病毒35S启动子驱动的表达的超过10倍(CHRISTENSEN and QUAIL 1996;CHRISTENSEN et al.1992)。
[0094] 除了对照玉米化i-1启动子之外，本申请还描述了新型玉米化i-1启动子。与来自 玉米基因型栽培种B73的对照化i-1启动子不同，新型化i-1启动子来自玉米基因型栽培种 化-II。还提供了使用包含多核巧酸序列的玉米化i-1启动子的构建体和方法。在一个实施 方案中，启动子可W包括来自玉米栽培种B73化i-1基因的多核巧酸，如下：
[0095] GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATA TTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATA TAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAA TTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGC TTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAAT TTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTT AATAGTTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACT AAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACC AGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTC GAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCC GGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTT TCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCA CACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCC CCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCA TGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACA CGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCG ATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTT GTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGAT CGGAGTAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATATTCAT AGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCA TATACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGG AGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATGTGTGTGTCATACATCTTCATAGT TACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACA TGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATA ATTATTTCGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATA CGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCA(SEQ ID N0:1)
[0096] 在一个实施方案中，启动子可W包括来自玉米栽培种化-II Ubi-1基因的多核巧 酸序列，如下：
[0097] GACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAAAGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACAATTTTTTAAGT GCAGTTTACGTATCTCTATACATATATTTAAACTTTACTATACGAATAATATAGTTTATAATACTAAAATAATATCA GTGTTTTAGAGAATTATATAAATGAACTGCTAGACATGGTCTAAATAACAATTGAGTGTTTTGACAACAGGACTCTA CAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTCCTATTTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCACCAATT TATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTCTATAGACTAATTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTT TAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTTTATTTTAGTTTTTTTAATAATTTAGATATAAATAGAATAAAATAAAGT GACTAAAAATTAACTAAATACCTTTTAAAAAAATAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTCCGAGTAGATAATGA CAGGCTGTTCAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAG CAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTG TCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGGCGGCACGGCAGGCGGCCTCTTCCTCCTCTCACGGCA CCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCC CTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTCGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCC GTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCATCCTCCCCCCCCCCCCCCCTCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGT TCCGGTCCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTG CTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACATCAGACATGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGG GGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTT GGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGTTTTTTTTTGGCT TGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGGATT TATTAAAGGATCTGTATGTATGTGCCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTA GGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTTTTTCGCTTGGTTGTGATGAT GTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTAACTGGTGGATTTATTAATTTTGGA TCTGTATGTGTGTGCCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGATGGATGGAAGTATCGATCTAGGATAGGTAT ACATGTTGATGTTGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATTCATATGCTCTAACCTT GAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGC AGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCTCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGC TCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCAG(SEQ ID NO:2)
[0098] 对本文所描述的启动子通过克隆W及随后的DM序列同源性分析进行了表征，W 鉴定启动子的特定区域（即，上游的启动子，5'-UTR，和内含子区域）。提供了使用组成型玉 米化i-1启动子在植物中表达转基因的构建体和方法，其包括上游启动子区，5-UTR或前导 区，和内含子。在一个实施方案中，启动子可W包括来自玉米栽培种B73 Ubi-1基因的上游 启动子多核巧酸序列，如下：
[0099] GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATA TTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATA TAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAA TTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGC TTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAAT TTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTT AATAGTTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACT AAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACC AGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTC GAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCC GGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTT TCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTT(沈Q ID N0:3)
[0100] 在另一个实施方案中，启动子可W包括来自玉米栽培种化-II Ubi-1基因的上游 启动子多核巧酸序列，如下：
[0101] GACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAAAGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACAATTTTTTAAGT GCAGTTTACGTATCTCTATACATATATTTAAACTTTACTATACGAATAATATAGTTTATAATACTAAAATAATATCA GTGTTTTAGAGAATTATATAAATGAACTGCTAGACATGGTCTAAATAACAATTGAGTGTTTTGACAACAGGACTCTA CAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTCCTATTTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCACCAATT TATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTCTATAGACTAATTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTT TAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTTTATTTTAGTTTTTTTAATAATTTAGATATAAATAGAATAAAATAAAGT GACTAAAAATTAACTAAATACCTTTTAAAAAAATAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTCCGAGTAGATAATGA CAGGCTGTTCAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAG CAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTG TCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGGCGGCACGGCAGGCGGCCTCTTCCTCCTCTCACGGCA CCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCC CTCCACACCCTCTT(沈Q ID N0:4)
[0102] 其他的基因调节元件
[0103] 转基因表达还可W受到位于上游启动子序列3'下游的5'-UTR和/或内含子区的调 节。包含与5'-UTR和/或内含子可操作连接的上游启动子区的启动子能够调节转基因的表 达。上游启动子是驱动转录必需的，而5'-UTR和/或内含子的存在能够增加表达水平，导致 产生更多的mRNA转录物用于翻译和蛋白质合成。在上游启动子多核巧酸序列中添加5'-UTR 和/或内含子能够帮助转基因的稳定表达。
[0104] 此外，包含上游启动子多核巧酸序列的组成型启动子的后面可W跟随5'-UTR或前 导序列，W帮助转基因在植物内的表达。在一个实施方案中，启动子可W包括来自玉米栽培 种B73化i-1基因的5'-UTR或前导多核巧酸序列，如下：
[0105] TCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCT TCAAG(SEQ ID NO:5)
[0106] 在另一个实施方案中，启动子可W包括来自玉米栽培种化-II Ubi-1基因的5'- UTR或前导多核巧酸序列，如下：
[0107] TCCCCAACCTCGTGTTCGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGC TTCAAG(SEQ ID NO:6)
[010引进一步地，包含上游启动子多核巧酸序列后随5'-UTR或前导序列的组成型启动子 还可W后随内含子，W帮助转基因在植物内的表达。在一个实施方案中，启动子可W包括来 自玉米栽培种B73化i-1基因的内含子多核巧酸序列，如下：
[0109] GTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGCATGGTTAGGG CCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACAC GGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTC TAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTT ATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGT CTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGT ATGTGTGTGCCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATG TTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCG GTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATG TGTGTGTCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATG TGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATT ATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTCGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGG ATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTG GTGTTACTTCTGCA(SEQ ID NO:7)
[0110] 在另一个实施方案中，启动子可W包括来自玉米栽培种化-II Ubi-1基因的内含 子多核巧酸序列，如下：
[0111] GTACGCCGCTCATCCTCCCCCCCCCCCCCCCTCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAGGGCC CGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGG ATGCGACCTGTACATCAGACATGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTA GCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTAT TTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGTTTTTTTTTGGCTTGGTTGTGATGATGTGGTCT GGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAAAGGATCTGTATGTA TGTGCCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGAT GCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTTTTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCG TTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTAACTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATAC ATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGATGGATGGAAGTATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTTGGTTTTA CTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAAT AAACAAGTATGTTTTATAATTATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTT TTTAGCTCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTT ACTTCTGCAG(SEQ ID NO:8)
[0112] 转基因和报告基因表达盒
[0113] 转基因表达还可W受到基因表达盒的调节。在一个实施方案中，基因表达盒包括 启动子。在一个实施方案中，基因表达盒包括化i-1启动子。在一个实施方案中，基因表达盒 包括来自植物的化i-1启动子。在一个实施方案中，基因表达盒包括来自玉米栽培种化-II 的化i-1启动子。
[0114] 在一个实施方案中，基因表达盒包括玉米栽培种化-II Ubi-1启动子，其中该启动 子与SEQ ID N0:2具有至少80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98 %，99 %，99.5 %，99.8 %，或100 %的同一性。在一个实施方案中，基因表达盒包括组成型 启动子，例如玉米栽培种化-II Ubi-1启动子，其与报告基因或转基因可操作连接。在一个 实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的组成型启动子，其中该转基因可W是 杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质 转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。在一个实施方案中，包含组成型启 动子的基因表达盒可W驱动一个或多个转基因或报告基因的表达。在一个实施方案中，包 含组成型启动子的基因表达盒可W驱动两个或多个转基因或报告基因的表达。
[0115] 在一个实施方案中，基因表达盒包括玉米栽培种化-II Ubi-1启动子，其中上游启 动子序列与SEQ ID N0:4至少80% ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97%, 98% ,99% ,99.5% ,99.8%，或100%相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括组成型启动 子，例如玉米栽培种化-II Ubi-1上游启动子，其与报告基因或转基因可操作连接。在一个 实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的组成型上游启动子，其中该转基因可 W是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养 品质转基因，DM结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。在一个实施方案中，包含组成 型上游启动子的基因表达盒可W驱动一个或多个转基因或报告基因的表达。在一个实施方 案中，包含组成型上游启动子的基因表达盒可W驱动两个或更多个转基因或报告基因的表 达。在进一步的实施方案中，上游启动子可W包括内含子。在一个实施方案中，上游启动子 可W包括与报告基因或转基因可操作连接的内含子序列。在另一个实施方案中，上游启动 子可W包括5'-UTR或前导序列。在一个实施方案中，上游启动子可W包括与报告基因或转 基因可操作连接的5'-UTR或前导序列。在另外一个实施方案中，上游启动子可W包括5'- UTR或前导序列和内含子序列。在一个实施方案中，上游启动子可W包括与报告基因或转基 因可操作连接的5 '-UTR或前导序列和内含子序列。
[0116] 在一个实施方案中，基因表达盒包括玉米栽培种化-II Ubi-1启动子，其中该5'- 1^'尺或前导序列与560 1〇^:6至少80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%， 97% ,98% ,99% ,99.5% ,99.8%，或100%相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括来自 编码泛素-1蛋白的玉米基因的或前导序列，其与启动子可操作连接，其中该启动子是玉米 栽培种化-II Ubi-1启动子，或者来自植物(例如玉米泛素-1启动子）、病毒(例如木馨叶脉 花叶病毒启动子），或细菌(例如±壤杆菌delta mas)的启动子。在一个例示性实施方案中， 基因表达盒包括玉米栽培种化-II 5'-UTR或前导序列，其来自编码泛素-1蛋白的玉米基 因，并与转基因可操作连接，其中该转基因可W是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因， 氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基 因，或其组合。
[0117] 在一个实施方案中，基因表达盒包括玉米栽培种化-II Ubi-1启动子，其中内含子 序列与沈Q ID N0:8至少80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99% ,99.5% ,99.8%，或100%相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括来自编码泛素-1 蛋白的玉米基因的内含子，其与启动子可操作连接，其中该启动子是玉米栽培种Hi-II 邮i-1启动子，或者来自植物(例如玉米泛素-1启动子）、病毒(例如木馨叶脉花叶病毒启动 子），或细菌(例如±壤杆菌delta mas)的启动子。在一个例示性实施方案中，基因表达盒包 括来自编码泛素-1蛋白的玉米基因的内含子，其与转基因可操作连接，其中该转基因可W 是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品 质转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。
[0118] 在一个实施方案中，载体可W包括如本文所述的基因表达盒。在一个实施方案中， 载体可W是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、隧菌体、病毒、或用于直接转化或基因祀定 的切离的多核巧酸片段，例如供体DNA。
[0119] 在一个实施方案中，细胞或植物包括如本文所述的基因表达盒。在一个实施方案 中，细胞或植物包括包含如本申请中公开的基因表达盒的载体。在一个实施方案中，载体可 W是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、隧菌体、或病毒。据此，包含基因表达盒的细胞或植 物分别是转基因细胞或转基因植物。
[0120] 在一个实施方案中，转基因植物可W是单子叶植物或双子叶植物。转基因单子叶 植物的实施方案可W是，但不仅限于，玉米、小麦、水稻、高梁、燕麦、黑麦、香蕉、甘薦、和小 米。转基因双子叶植物的实施方案可W是，但不仅限于大豆、棉花、向日葵、或芥花。实施方 案还包括来自转基因植物的转基因种子，如本文所述的。
[0121] 选择标志物
[0122] 各种选择标志物，也称为报告基因，可W整合到所选表达载体中，W允许鉴定和选 择被转化的植物（"转化体"）。有多种方法可用于确认选择标志物在转化的植物中的表达， 包括例如DNA测序、聚合酶链式反应(PCR)、Southern印迹、RNA印迹、用于检测从载体表达的 蛋白质的免疫学方法，例如介导麟丝菌素抗性的沉淀蛋白，或者视觉观察其它蛋白质，例如 编码e-葡糖巧酸酶(GUS)、巧光素酶、绿色巧光蛋白（GFP)、黄色巧光蛋白（YFP)、DsRed、0-半 乳糖巧酶、氯霉素乙酷转移酶（CAT)、碱性憐酸酶等的报告基因（参见Sambrook，et al.， Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,第；片反，Cold Spring Harbor Press,N.Y., 2001，其全部内容通过引用并入本文）。
[0123] 选择标志物基因用于选择被转化的细胞或组织。选择标志物基因包括编码抗生素 抗性的基因，例如编码新霉素憐酸转移酶II(NEO)和潮霉素憐酸转移酶化PT)的基因，W及 赋予对除草化合物抗性的基因。除草剂抗性基因一般编码经过修饰的对除草剂不敏感的祀 蛋白，或者编码在除草剂在植物中发挥作用之前将其降解或脱毒的酶。例如，已经通过使用 编码突变型祀酶，5-締醇丙酬莽草酸-3-憐酸合酶化PSPS)，的基因而获得了对草甘麟的抗 性。EPSPS的基因和突变体是众所周知的，并且在下文中有进一步的描述。对草胺麟锭盐、漠 苯腊和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-0)的抗性已经通过使用编码9曰1:或051-2、腊水解酶、曰曰(1-1 或aad-12基因的细菌基因得W实现，运些基因可W将各自的除草剂脱毒。
[0124] 在一个实施方案中，除草剂可W抑制生长点或分生组织，包括咪挫嘟酬或横酷脈， 且用于抵抗/耐受运些除草剂的乙酷径酸合酶(AHAS)和乙酷乳酸合酶(ALS)的基因。草甘麟 抗性基因分别包括突变的5-締醇丙酬莽草酸-3-憐酸合酶化PSPS)和dgt-28基因（通过引入 重组核酸和/或各种形式的天然EPSP基因的体内诱变），aroA基因和草甘麟乙酷转移酶 (GAT)基因。对其它含麟化合物的抗性基因包括来自链霉菌属，包括吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)和Streptomyces viridichromogenes，的BAR基因，和口比晚 氧基(pyridinoxy)或苯氧基(phenoxy)丙酸和环己酬(ACC酶抑制剂编码基因）。可赋予对环 己二酬和/或芳氧苯氧丙酸（a巧1〇巧地enoxypropanoic acid)(包括盖草能，禾草灵，嗯挫 禾草灵，化氣禾草灵，精哇禾灵）的抗性的示例性基因包括乙酷辅酶A簇化酶(ACC酶)一一 Accl-Sl，Accl-S2和ACC1-S3的基因。在一个实施方案中，除草剂能够抑制光合作用，包括S 嗦(psbA和ls+基因）或节腊(腊水解酶基因）。
[0125] 在一个实施方案中，选择标志物包括，但不仅限于，编码如下的基因：新霉素憐酸 转移酶II;氨腊水合酶;天冬氨酸激酶;二氨化晚二簇酸合酶;色氨酸脱簇酶;二氨化晚二簇 酸合酶和脱敏的天冬氨酸激酶;bar基因；色氨酸脱簇酶;新霉素憐酸转移酶(NE0);潮霉素 憐酸转移酶化PT或肌G);二氨叶酸还原酶(畑FR);麟丝菌素乙酷转移酶;2,2-二氯丙酸脱面 素酶；乙酷径酸合成酶;5-締醇丙酬酸-莽草酸-憐酸合酶(aroA);面代乙腊；乙酷辅酶A簇化 酶;二氨蝶酸合酶(sul I);和32kD光系统II多肤(psbA)。
[0126] 实施方案还包括编码对如下者的抗性的基因：氯霉素；甲氨蝶岭；潮霉素;壮观霉 素;漠苯腊;草甘麟;和麟丝菌素。
[0127] 上述的选择标志物基因的列表并不意味着有限制性。本发明可W包含任何报告或 选择标志物基因。
[0128] 选择标志物基因 W在植物中最佳表达为目的而合成。例如，在一个实施方案中，基 因的编码序列已经被密码子优化修饰，w提高在植物中的表达。选择标志物基因可w被优 化用于在特定的植物物种中表达，或者，可W被修饰用于在双子叶或单子叶植物中最佳表 达。植物优选的密码子可W从感兴趣的特定植物物种中W表达量最大的蛋白质的频率最高 的密码子中确定。在一个实施方案中，选择标志物基因被设计成在植物中W更高的水平被 表达，从而产生更高的转化效率。对于植物基因优化的方法是众所周知的。关于合成多核巧 酸序列的优化和制造的指导可见于，例如，W02013016546，W02011146524，W01997013402,美 国专利6166302和美国专利5,380,831，其内容通过引用并入本文。
[0129] 转基因
[0130] 公开的方法和组合物可用于在植物基因组中表达多核巧酸基因序列。因此，编码 除草剂抗性、昆虫抗性、营养、抗生素或治疗性分子的基因的表达可W被新型启动子驱动。
[0131] 在一个实施方案中，本公开的组成型启动子调节元件与一个或多个编码多核巧酸 序列的基因组合或可操作连接，该基因可提供对草甘麟、2,4-D、草锭麟或其他除草剂的抗 性或耐受性，提供对选择昆虫或疾病的抗性或耐受性，和/或营养增强，改良的农学特征，用 于在饲料、食品、工业、医药或其它用途中有用的蛋白质或其它产品。转基因可W在植物基 因组中与两个或多个感兴趣的核酸序列"堆叠"。堆叠可W通过例如使用两个或多个事件的 传统植物育种，用含有感兴趣序列的构建体转化植物，转基因植物的再转化，或者通过同源 重组的祀向整合添加新的性状，来实现。
[0132] 运些感兴趣的多核巧酸序列包括，但不仅限于，下面提供的实例：
[0。引 1.赋予害虫或疾病抗性的转基因或编码序列(例如iRNA)
[0134] (A)植物疾病抗性基因。植物防御经常通过植物中疾病抗性基因(R)的产物与病原 体中相应的无毒性(Avr)基因的产物的特异相互作用而被激活。可W用克隆的抗性基因转 化植物品种，从而工程构建对特定病原体株有抗性的植物。运些基因的实例包括:提供黄枝 抱霉（Cladosporium fulvum)抗性的番茄Cf-9 基因 （Jones et al., 1994 Science 266: 789);，提供下香假单胞杆菌番茄致病变种抗性的番茄Pto基因，其编码一种蛋白激酶 (Madin et al.，1993 Science 262:1432)，和提供下香假单胞菌抗性的拟南芥RSSP2基因 (Mindrinos et al.，1994 Cell 78:1089)。
[0135] (B)苏云金芽抱杆菌蛋白质、其衍生物或W其为模本的人造多肤，例如化S-内毒素 基因的多核巧酸序列（Geiser et al.，1986 Gene 48:109)和植物杀虫(VIP)基因（见，例 如，Estruch et al.(1996)P;roc .Natl .Acad. Sci . 93:5389-94)。此外，编码S-内毒素基因的 DM分子可W从美国典型培养物保藏中屯、（Rockville，Md.)购得，ATCC登录号为40098， 67136,31995和31998。
[0136] (C)植物凝集素，例如，多种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合性植物凝集素基 因的核巧酸序列（化n Damme et al. ,1994 Plant Molec.Biol.24:825)。
[0137] (D)维生素结合蛋白质，例如亲和素及亲和素同源物，其可用作针对昆虫类害虫的 杀幼虫剂。见美国专利5，659，026。
[0138] 化)酶抑制剂，例如蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。运些基因的实例包括水稻半脫 氨酸蛋白质酶抑制剂(Abe et al. ,1987 J.Biol.化em.262:16793)，烟草蛋白酶抑制剂I 化uubetal.，1993 PlantMolec.Biol.21:985)，和a-淀粉酶抑制剂（Sumitanietal.， 1993 Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)。
[0139] (F)昆虫特异性激素或信息素，例如蚁皮激素和保幼激素或其变体、基于它们的模 拟物，或其括抗剂或激动剂，例如杆状病毒表达的克隆保幼激素醋酶，保幼激素的失活子 (Hammock et al.,1990 Na1:ure 344:458)。
[0140] (G)昆虫特异性肤或神经肤，其在表达时会扰乱受影响的害虫的生理机能 (J.Biol.化em. 269:9)。运些基因的实例包括昆虫利尿激素受体(Regan, 1994)，在太平洋折 翅赚(Diploptera punctata)中鉴定的咽侧体抑制素（allostatin) (Pratt, 1989)，和昆虫 特异性麻搏神经毒素(美国专利No. 5，266，361)。
[0141] 化)在自然界中由蛇、马蜂等产生的昆虫特异性毒液，例如蜗子昆虫毒性肤(Pang, 1992 Gene 116:165)。
[0142] (I)负责超富集单祗、倍半祗、酱体、异径朽酸、苯丙烷衍生物或其它具有杀虫活性 的非蛋白质分子的酶。
[0143] (J)参与生物活性分子修饰(包括翻译后修饰）的酶；例如糖酵解酶、蛋白质水解 酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、醋酶、水解酶、憐酸酶、激酶、憐酸化酶、聚合酶、弹 性蛋白酶、几下质酶和葡聚糖酶，无论是天然的还是人造的。运些基因的实例包括马蹄莲 (callas)基因（PCT公开的申请W0 93/02197)，几下质酶编码序列（其可W从例如ATCCW登 录号3999637和67152获得），烟草钩虫几下质酶（Kramer et al. ,1993 Insect Molec.Biol.23:691)，和欧芹ubi4-2多聚泛素基因化awalleck et al. ,1993 Plant Molec.Biol.21:673)。
[0144] 化)刺激信号转导的分子。运些分子的实例包括绿豆巧调蛋白cDNA克隆的核巧酸 序列（Botella et al. ,1994 Plant Molec.Biol.24:757)，和玉米巧调蛋白cDNA克隆的核 巧酸序列(Griess et al., 1994 Plant F*hysiol. 104:1467)。
[0145] (L)疏水矩肤化yho曲obic moment peptide)。见例如美国专利Nos.5,659,026和 5，607，914，后者教导了赋予疾病抗性的人造抗微生物肤。
[0146] (M)膜透性酶，通道形成剂或通道阻断剂，例如杀菌肤-0裂解肤类似物(Jaynes et al. ,1993 Plant Sci.89:43)，其使转基因烟草植物对青枯病有抗性。
[0147] (N)病毒侵袭性蛋白质或由其衍生的复杂毒素。例如，在经转化的植物细胞中，病 毒衣壳蛋白的积累可赋予针对该衣壳蛋白所来源的病毒W及相关病毒所致的病毒感染和/ 或疾病发展的抗性。已经给转化植物赋予了衣壳蛋白介导的，针对首猜花叶病毒、黄瓜花叶 病毒、烟草条纹病毒、马铃馨X病毒、马铃馨Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶 病毒的抗性。参见，例如，Beachy et al. (1990)Ann.Rev.F*h}ftopathol.28:451。
[0148] (0)昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素。因此，祀向昆虫肠道关键代谢功能的 抗体可W使受影响的酶失活，杀死昆虫。例如，Taylor等人(1994)，在第屯届国际分子植物- 微生物相互作用研讨会（Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant Microbe Interactions)上的第497号摘要显示了转基因烟草中通过产生单链抗体片段的酶失活。
[0149] (P)病毒特异性抗体。见例如hvladoraki et al. (1993)化 1:ure 266:469,其显示 了表达重组抗体基因的转基因植物被保护免于病毒攻击。
[0150] (Q)由病原体或寄生物自然产生的发育阻滞(developmen^^arrestive)蛋白质。 因此，真菌内切Q-1，4-D多聚半乳糖醒酸酶通过溶解植物细胞壁的均聚-a-1，4-D-半乳糖醒 酸而促进真菌定殖和植物营养素释放化amb et al.,1992)Bio/Technology 10:1436。 1'〇油曰的等（1992 Plant J.2:367)描述了豆类内切多聚半乳糖醒酸酶抑制蛋白的编码基因 的克隆和表征。
[0151] (R)由植物自然产生的发育阻滞(developmental-arrestive)蛋白质，例如大麦核 糖体失活基因，其提供了增加的针对真菌疾病的抗性化ongemann et al.，1992) .Bio/ Technology 10:3305。
[0152] (S)RNA干扰，其中用RNA分子抑制祀基因的表达。一个实施例中的RNA分子是部分 或完全双链的，其触发沉默响应，导致dsRNA被切割成小的干扰RNA，它们随后被纳入到祀向 复合体中，祀向复合体破坏同源的mRNA。见例如Fire等人，美国专利6,506,559; Graham等 人，美国专利6,573,099。
[。巧引 2.赋予除草剂抗性的基因
[0154] ( A )编码针对抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪挫嘟酬类 (imidazalinone)、横酷苯胺类（3111的]1日]1；[11(1日）或横酷脈类除草剂的抗性或耐受性的基 因。运类基因的实例编码一种突变ALS酶化ee et al.，1988 6]\?〇17:1241)，其也称4歴巧每 (Miki et al.,1990 Hieor.Appl.Genet.80:449)。
[0155] (B)-种或多种额外的编码针对草甘麟抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性 是由突变体EPSP合酶和aroA基因赋予的，或者是通过一些基因如DGT-28、2mEPSPS、GAT(草 甘麟乙酷转移酶)或G0X(草甘麟氧化酶)和其它麟酷基化合物，如草胺麟(pat, bar,和dsm-2 基因），和芳氧基苯氧基丙酸和环己二酬(ACC酶抑制剂编码基因）所致的代谢失活而获得 的。见例如美国专利4,940,835，其公开了可赋予草甘麟抗性的6?5?形式的核巧酸序列。编 码突变体aroA基因的DNA分子能够WATCC登录号39256获得，突变体基因的核巧酸序列在美 国专利4，769，061中公开。欧洲专利申请No. 0 333 033和美国专利4，975，374公开了可赋予 除草剂如心草锭麟抗性的谷氨酷胺合酶基因的核巧酸序列。欧洲专利申请No.0 242 246提 供了草锭麟乙酷转移酶基因的核巧酸序列。De Greef et al.(1989)Bio/Technology 7:61 中描述了表达编码草锭麟乙酷转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。赋予针对 芳氧基苯氧基丙酸和环己二酬如稀禾定和甲禾灵化aloxWop)的抗性的示例性基因是 Acc]_-Sl ,Acc]_-S2和Accl-S3基因，如Marshall et al. (1992)111601^.Appl .Genet.83:435所 述。
[0156] (C)编码针对可抑制光合作用的除草剂例如=嗦(psbA和gs+基因）和节腊(腊水解 酶基因）的抗性的基因。Prz化illaetal.a991)PlantCell3:169描述了使用编码突变 体psbA基因的质粒转化衣藻。在美国专利4,810,648中公开了腊水解酶基因的核巧酸序列， 含有运些基因的DNA分子可W通过ATCC登录号53435、67441和67442获得。Hayes et al. (1992)81〇油6111.1285:173中描述了编码谷脫甘肤5-转移酶的0臟的克隆和表达。
[0157] (D)编码针对可结合径基苯基丙酬酸二加氧酶化PPD)的除草剂的抗性基因 ，HPPD 是催化对-?基苯基丙酬酸（HPP)转化形成尿黑酸的反应的酶。运包括例如异嗯挫 化口418175,6口470856,6口487352,6口527036,6口560482,6口682659，美国专利5,424,276)，特 别是异嗯挫草酬，其是玉米的选择性除草剂，二酬腊（diketonitrileKEP496630, EP496631)，特别是2-氯基-3-环丙基-1-(2-S02C册-4-CF3苯基）丙烷-1，3-二酬和2-氯基- 3-环丙基-1-(2-S02C 册-4-2，3C12 苯基）丙烷-1，3-二酬，S 酬类化 P625505，EP625508，美国 专利5,506，195)，特别是横草酬、和pyrazolinate等除草剂。在植物中产生过量HPPD的基因 能够提供针对运些除草剂的耐受性或抗性，包括例如美国专利6，268，549和6，245，968和美 国专利申请公开No. 2003/0066102中描述的基因。
[0158] 化)编码针对苯氧基生长素除草剂，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受 性的基因，其也可W赋予针对芳氧基苯氧基丙酸类(A0PP)除草剂的抗性或耐受性。运些基 因的实例包括a-酬戊二酸依赖性的双加氧酶(aad-1)基因，如美国专利7，838，733所述。
[0159] (F)编码针对苯氧基生长素除草剂如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受 性的基因，其也可W赋予针对化晚基氧基生长素除草剂，如氣草烟或绿草定的抗性或耐受 性。运些基因的实例包括a-酬戊二酸依赖性的双加氧酶(aad-12)基因，如W02007/053482- A2所述。
[0160] (G)编码针对麦草畏的抗性或耐受性的基因（见例如美国专利公开0030135879)。
[0161] 化)编码针对抑制原化嘟原氧化酶(PP0)的除草剂的抗性或耐受性的基因（见美国 专利No. 5,767,373)。
[0162] (I)提供针对可结合光系统II反应中屯、(PS II)核屯、蛋白质的S嗦除草剂(例如莽 去津）和尿素衍生物（如敌草隆）除草剂的抗性或耐受性的基因。见化ussian et al.， (1989)EMB0 J.1989,8(4):1237-1245。
[01创 3.可赋予或贡南犬数量叠加性状(Value Added Trait)的基因
[0164] (A)修饰的脂肪酸代谢，例如通过用反义基因或硬脂酷-ACP去饱和酶转化玉米或 芸苔属植物从而增加植物的硬脂酸含量化nultzon et al. ,1992)P;roc.Nat.Acad.Sci.USA 89:2624。
[0165] (B)降低的植酸含量
[0166] (1)引入植酸酶编码基因，如黑曲霉植酸酶基因 （Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87)，提高植酸降解，向被转化植物添加更多游离憐酸盐。
[0167] (2)可引入降低植酸含量的基因。在玉米中，运可W通过，例如，克隆然后重新导入 如下所述的单个等位基因的相关DNA来实现:该单个等位基因导致W植酸水平低为特征的 玉米突变体的原因 （Raboy et al. ,1990 Maydica 35:383)。
[0168] (C)改良的碳水化合物组成，例如通过用编码改变淀粉的分支模式的酶的基因转 化植物而实现。运些酶的实例包括，粘液链球菌(Streptococcus mucus)果糖基转移酶基因 (化iroza et al.,1988)J.Bacte;riol.170:810,枯草芽抱杆菌果聚糖薦糖酶基因 (Steinmetz et al.,1985 Mol.Gen.Genel.200:220)，地衣芽抱杆菌a-淀粉酶（Pen et al. ,1992 Bio/Technology 10:292)，番茄转化酶基因巧lliot et al. ,1993)，大麦淀粉酶 基因 （Sogaard et al. ,1993 J.Biol.Chem.268:22480)，和玉米胚乳淀粉分支酶 iKFisher et al., 1993 Plant F*hysiol. 102:10450)。
[0169] 转化
[0170] 用于转化植物的合适方法包括任何能够将DNA引入到细胞内的方法，例如但不仅 限于：电穿孔(参见例如美国专利5,384,253);微粒射弹(参见例如美国专利5,015,580;5， 550，318; 5，538，880; 6，160，208; 6，399，861;和6，403，865); ±壤杆菌介导的转化(参见例 如美国专利5,635,055 ;5,824,877; 5,591，616;5,981,840;和 6,384,301);和原生质体转化 (参见例如美国专利5,508，184)。运些方法可用于稳定转化或瞬时转化植物。
[0171] DNA构建体可W使用下述技术直接引入到植物细胞的基因组DNA中，例如用碳化娃 纤维揽动(参见，例如，美国专利5,302,523和5,464,765)，或者DNA构建体可W使用生物射 弹方法，例如DNA粒子轰击，直接引入到植物组织中（参见，例如，Klein et al. ,(1987) 化ture 327 :70-73)。或者，DNA构建体可W通过纳米颗粒转化引入到植物细胞中（参见，例 如，美国专利公开No. 2009/0104700，通过提述将其整体并入本文）。
[0172] 此外，基因转移可W使用非±壤杆菌或病毒实现，例如根瘤菌NGR234、首猜中华根 瘤菌、中慢生根瘤菌、马铃馨X病毒、花挪菜花叶病毒、木馨叶脉花叶病毒和/或烟草花叶病 毒，参见例如，Qiung et 日1.,(2006)化611(13 Plant Sci.ll(l):l-4。
[0173] 通过运些转化技术的应用，几乎任何植物物种的细胞都可W被稳定地转化，并且 运些细胞可W通过众所周知的技术发育成转基因植物。例如，美国专利5，846，797; 5，159， 135 ; 5，004，863和6，624，344中描述了特别可用于棉花转化内容的技术；例如美国专利5， 750,871中描述了特别用于转化芸苔属植物的技术;美国专利6,384,301中描述了用于转化 大豆的技术;美国专利7,060,876和5,591，616和国际口(：1'公开胖0 95/06722中描述了用于转 化玉米的技术。
[0174] 在将外源核酸递送到受体细胞之后，通常要鉴定出转化细胞用于进一步的培养和 植物再生。为了提高鉴定转化体的能力，可能期望采用选择标志物基因，与用于产生转化体 的转化载体一起使用。在示例性实施方案中，可W通过将细胞暴露于一种或多种选择剂对 被转化的细胞群体进行测定，或者可W根据期望的标记基因性状对细胞进行筛选。
[0175] 对于在暴露于选择剂时存活的细胞，或者在筛选测定中被评定为阳性的细胞，可 W在支持植物再生的培养基中加 W培养。在一个实施方案中，可W对任何合适的植物组织 培养基进行修改，使之包含更多的物质，例如生长调节剂。植物组织可W维持在含有生长调 节剂的基础培养基中，直到可W获得足够的组织用于开始植物再生工作，或者经过重复多 轮的人工选择，直到组织的形态适合于再生为止(例如，至少2周），然后可W将组织转移到 有助于芽形成的培养基中。周期性地转移培养物，直到发生充分的芽形成。一旦形成芽，便 将它们转移到有助于根形成的培养基中。一旦形成了足够的根，可将植物转移到±壤中，用 于进一步的生长和成熟。
[0176] 为了确认再生植物中存在包含所提供构建体的期望核酸，可W多种测定。运样的 测定可W包括:分子生物学测定，例如Southern和Nodhern印迹和PCR;生物化学测定，通过 免疫学方法如化ISA，western印迹，和/或LC-MS MS分光光度法，或者通过酶促功能检测蛋 白质产物的存在，例如通过植物部分测定法，例如叶、愈伤组织或花粉测定;和/或分析整个 再生植物的表型。
[0177] 可W通过例如PCR扩增，使用特异针对感兴趣的核酸分子的寡核巧酸引物对转基 因事件进行筛选。PCR基因分型被理解为包括，但不仅限于，对分离和/或纯化自预计含有整 合在基因组内的感兴趣核酸分子的宿主植物组织的基因组DNA进行PCR扩增，随后进行常规 克隆和PCR扩增产物序列分析。PCR基因分型方法已经有充分描述(参见，例如，Rios et al. (2002)Plant J.32:243-53)，并且可应用于来自任何植物物种或组织类型（包括细胞培养 物）的基因组DNA。一组结合祀序列和引入序列的寡核巧酸引物可W在PCR扩增反应中顺次 使用或复用。可W产生设计为结合祀位点、引入核酸序列、和/或运两种类型的核酸序列之 组合的寡核巧酸引物。因此，PCR基因分型策略可W包括，例如但不仅限于:扩增植物基因组 中的特有序列;扩增植物基因组中的多个特有序列;扩增植物基因组中的非特有序列;和上 述的任意组合。本领域的技术人员可w设计出其它的引物和扩增反应的组合来查询基因 组。例如，可W设计一组正向和反向寡核巧酸引物，使之与引入核酸序列的边界之外的祀标 特有序列退火。
[0178] 正向和反向寡核巧酸引物可被设计为与引入的核酸分子特异性退火，例如在引入 的核酸分子中包含的感兴趣核巧酸序列内的编码区的相应序列处退火，或者在该核酸分子 的其它部分退火。引物可W和本文描述的引物联合使用。寡核巧酸引物可W根据期望的序 列合成，并且是可商购的（例如，从Integrated DNA Technologies,Inc. ,Coralville,IA)。 扩增之后可W进行克隆和测序，或者对扩增产物直接进行序列分析。在一个实施方案中，在 PCR扩增中使用特异针对基因祀标的寡核巧酸引物。
[0179] 表达转基因的方法
[0180] 在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一 个转基因可操作连接的玉米栽培种化-II Ubi-1启动子(SEQ ID NO: 2)的植物。在一个实施 方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转 基因可操作连接的玉米栽培种化-II化i-1启动子(SEQ ID N0:2)的植物组织或植物细胞。
[0181] 在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一 个转基因可操作连接的玉米栽培种化-II Ubi-1启动子(SEQ ID N0:2)的基因表达盒的植 物。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培养包 含与至少一个转基因可操作连接的玉米栽培种化-II Ubi-1启动子(SEQ ID NO: 2)的基因 表达盒的植物组织或植物细胞。
[0182] 在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，其包括与转基因 可操作连接的玉米栽培种化-II Ubi-1启动子（SEQ ID NO: 2)。其中，该玉米栽培种化-II Ubi-1 启动子(SEQ ID N0:2)包括上游启动子(SEQ ID N0:4)、5'-UTR(SEQ ID N0:6)、和内 含子(SEQ ID NO:8)。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，其包 括玉米栽培种化-II Ubi-1上游启动子(SEQ ID N0:4)、5'-UTR(SEQ ID N0:6)、和内含子 (SEQ ID NO:8)。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，其包括玉 米栽培种化-II Ubi-1上游启动子(SEQ ID N0:4)、5'-UTR(SEQ ID N0:6)、和玉米栽培种 Hi-II Ubi-1基因的内含子(SEQ ID N0:8)。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞 包括基因表达盒，其包括玉米栽培种化-II Ubi-1上游启动子(SEQ ID N0:4)、5'-UTR(SEQ ID N0:6)和玉米栽培种化-II化i-1基因的内含子(SEQ ID N0:8)。
[0183] 在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括玉米栽培种化-II化i-1启动 子。在一个实施方案中，玉米栽培种化-II Ubi-1启动子可W是SEQ ID N0:2。在一个实施方 案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒包含启动子，其中该启 动子与沈Q ID N0:2至少80% ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98%, 99 %，99.5 %，99.8 %，或100 %相同。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基 因表达盒，所述基因表达盒包含与转基因可操作连接的玉米栽培种化-II化i-1启动子。在 一个示例性实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒包含 与转基因可操作连接的玉米栽培种化-II Ubi-1启动子，其中该转基因可W是杀虫抗性转 基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因 ，DNA 结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。
[0184]在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括玉米栽培种化-II化i-1上游 启动子。在一个实施方案中，玉米栽培种化-II化i-1上游启动子可W是SEQ ID N0:4。在一 个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒包含上游启动 子，其中该上游启动子与SEQ ID N0:4至少80% ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95%, 96%，97% ,98% ,99% ,99.5% ,99.8%，或100%相同。在一个实施方案中，植物、植物组织 或植物细胞包括基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的玉米栽培种化-II Ubi-1上游 启动子。在一个示例性实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，其包含与 转基因可操作连接的玉米栽培种化-II Ubi-1上游启动子，其中该转基因可W是杀虫抗性 转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因， DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。
[01化]在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括玉米栽培种化-II Ubi-1 5'- UTR或前导序列。在一个实施方案中，玉米栽培种Hi-II Ubi-1 5'-UTR或前导序列可W是 SEQ ID N0:6的多核巧酸。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒， 所述基因表达盒含有5'-UTR或前导序列，其中该5'-UTR或前导序列与SEQ ID NO:6至少 80% ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98% ,99% ,99.5% ,99.8%,或 100%相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括与启动子可操作连接的玉米栽培种化-II Ubi-1 5'-UTR或前导序列，其中该启动子是泛素启动子，或者来自植物(例如玉米泛素-1启 动子）、病毒(例如木馨叶脉花叶病毒启动子），或细菌(例如±壤杆菌delta mas)的启动子。 在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒含有与转 基因可操作连接的玉米栽培种化-II Ubi-1 5'-UTR或前导序列。在一个示例性实施方案 中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒含有与转基因可操作连接 的玉米栽培种化-II师i-1 5'-UTR或前导序列，其中该转基因可W是杀虫抗性转基因，除 草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基 因，选择标志物转基因，或其组合。
[0186] 在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括化i-1内含子。在一个实施方 案中，植物、植物组织或植物细胞包括玉米栽培种化-II Ubi-1内含子。在一个实施方案中， 玉米栽培种化-II化i-1内含子可W是SEQ ID N0:8的多核巧酸。在一个实施方案中，植物、 植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒含有内含子，其中该内含子与SEQ ID NO: 8 至少 80 % ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98% ,99%， 99.5% ,99.8%，或100%相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括与启动子可操作连接的 玉米栽培种化-II Ubi-1内含子，其中该启动子是泛素启动子，或者来自植物(例如玉米泛 素-1启动子）、病毒(例如木馨叶脉花叶病毒启动子），或细菌(例如±壤杆菌delta mas)的 启动子。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒 含有与转基因可操作连接的玉米栽培种化-II Ubi-1内含子。在一个示例性实施方案中，植 物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒含有与转基因可操作连接的玉 米栽培种化-II Ubi-1内含子，其中该转基因可W是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基 因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基因，选择标志物 转基因，或其组合。
[0187] 在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括与转基因可操作连接的玉米 栽培种化-II Ubi-1上游启动子、Ubi-1内含子和化i-1 5'-UTR。当基因表达盒包括2个或更 多个转基因时，该玉米栽培种化-II Ubi-1上游启动子、Ubi-1内含子和化i-1 5'-UTR可W 和基因表达盒内的不同转基因可操作连接。在一个示例性实施方案中，基因表达盒包括与 转基因可操作连接的玉米栽培种化-II Ubi-1启动子，其中该转基因可W是杀虫抗性转基 因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结 合转基因，选择标志物转基因，或其组合。在一个示例性实施方案中，基因表达盒包括与转 基因可操作连接的玉米栽培种化-II Ubi-1内含子，其中该转基因可W是杀虫抗性转基因， 除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转 基因，选择标志物转基因，或其组合。在一个实施方案中，基因表达盒包括与启动子可操作 连接的玉米栽培种化-II Ubi-1内含子，其中该启动子是泛素启动子，或者来自植物(例如 玉米泛素-1启动子）、病毒（例如木馨叶脉花叶病毒启动子），或细菌（例如±壤杆菌delta mas)的启动子。在一个示例性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米栽 培种化-II Ubi-1 5'-UTR，转基因可W是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效 率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其 组合。
[0188] 在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有如本文所述的组成型基 因启动子调节元件的载体。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有如本文 所述的与转基因可操作连接的组成型基因启动子调节元件的载体。在一个实施方案中，植 物、植物组织或植物细胞包括含有如本文所述的基因表达盒的载体。在一个实施方案中，载 体可W是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、隧菌体、或病毒片段。
[0189] 在一个实施方案中，根据本文公开方法的植物、植物组织或植物细胞可W是单子 叶植物。该单子叶植物、植物组织或植物细胞可W是，但不仅限于，玉米，水稻，小麦，甘薦， 大麦，黑麦，高梁，兰花，竹子，香蕉，香蒲，百合，燕麦，洋葱，小米，和黑小麦。
[0190] 在另一个实施方案中，根据本文公开方法的植物、植物组织或植物细胞可W是双 子叶植物。该双子叶植物、植物组织或植物细胞可W是，但不仅限于，油菜，芥花(canola)， 印度芥，埃塞俄比亚芥，大豆，向日葵和棉花。
[0191] 关于遗传修饰植物的产生，用于将植物基因工程的方法是本领域众所周知的。例 如，已经开发了许多用于植物转化的方法，包括用于双子叶植物W及单子叶植物的生物和 物理转化方案（例如Goto-Fumiyukiet al.,化 ture Biotech 17:282-286( 1999) ;M;Lki et al.,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology ,G1ick,B.R.和 Thompson, J. E.编辑，CRC Press , Inc. ,Boca Raton,第67-88页（1993))。此外，用于植物细 胞或组织转化和植物再生的载体和体外培养方法可W在例如下列文献中获取:Gruber et al.,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology ,G1ick,B.R.和 HiompsonJ.E.编辑，CRC Press,Inc.,Boca Raton,第89-119页（1993)。
[0192] 本领域的技术人员会意识到，在外源序列稳定组入到转基因植物体内并被确认可 W工作之后，可W通过有性杂交将它引入到其它植物中。可W使用大量标准育种技术中的 任一种，取决于待杂交的物种。
[0193] 通过对经过工程化的植物材料选择或筛选由转化DNA上存在的标记基因所编码的 性状，可W鉴定并分离出转化的植物细胞、根、叶、愈伤组织、组织或植物。例如，可W通过在 含有抑制量的抗生素或除草剂(转化基因构建体可w赋予对该抗生素或除草剂的抗性）的 培养基上培育工程化的植物材料来进行选择。另外，还可W通过筛选重组核酸构建体上可 能存在的任何可见的标志物基因（例如，YFP，GFP，e-葡萄糖醒酸酶，巧光素酶，B或C1基因） 的活性来鉴定转化细胞。运些选择和筛选方法是本领域技术人员众所周知的。
[0194] 还可W使用物理和生物化学方法鉴定含有插入基因构建体的植物或植物细胞转 化体。运些方法包括但不仅限于：1) Southern分析或PCR扩增，用于检测和确定重组DNA插入 物的结构；2)Northern印迹、S1 RNA酶保护、引物延伸或逆转录酶-RNA扩增，用于检测并检 查基因构建体RNA转录本;3)酶学测定，用于检测酶或核酶活性，如果运样的基因产物由所 述基因构建体编码的话;4)二代测序(NGS)分析;或5)蛋白凝胶电泳、we stern印迹技术、免 疫沉淀或酶联免疫吸附测定巧LISA)，如果所述基因构建体的产物是蛋白质的话。也可W使 用其它的技术，例如原位杂交、酶染色和免疫染色，来检测重组构建体在特定植物器官和组 织中的存在或表达。实施运些实验的方法是本领域技术人员众所周知的。
[0195] 使用本文公开的方法进行的基因操作的效果可W通过，例如，从感兴趣的组织中 分离的RNA(例如，mRNA)的Nodhern印迹来进行观察。通常，如果存在mRNA或者mRNA的量增 加了，则可W推定相应的转基因被表达。可W使用其它用于测量基因和/或编码多肤活性的 方法。可W使用不同类型的酶测定，取决于所用的底物W及检测反应产物或副产物增加或 降低的方法。此外，多肤的表达水平可W用免疫化学手段测量，通过使用化ISA，RIA，EIA和 本领域技术人员众所周知的其它基于抗体的测定，例如通过电泳检测方法(无论是与染色 还是印迹法联用）。作为一个非限制性的实例，在美国专利公开号2009/0093366(通过提述 并入其全部内容）中描述了使用化ISA测定检测AAD-1 (芳氧基链烧酸双加氧酶；参见W0 2005/107437)和PAT(麟丝菌素-N-乙酷基转移酶)蛋白。转基因还可W选择性地在一些细胞 类型或植物组织中表达，或者在某些发育阶段中表达。转基因还可W在基本上所有的植物 组织中沿着其整个生命周期表达。然而，任何组合的表达模式也是可W使用的。
[0196] 本公开还包括上述转基因植物的种子，其中该种子包括报告基因、转基因、或基因 表达盒。本公开进一步包括上述转基因植物的后代、克隆、细胞系或细胞，其中所述后代、克 隆、细胞系或细胞包括所述报告基因、转基因或基因构建体。
[0197] 尽管已经参考具体的方法和实施方案对本发明进行了描述，但是应当意识到，在 不背离本文中描述的本发明的前提下可W进行各种修改和变化。 实施例
[0198] 实施例1:新型启动子鉴定和分离
[0199] 使用聚合酶链式反应(PCR)从玉米栽培种化-n的化i-1基因扩增了新型启动子序 列。设计用于扩增该新型启动子，称为玉米栽培种化-II，的寡核巧酸(表1)来自于用作对照 的玉米栽培种B73化i-1启动子序列的保守区。从玉米栽培种化-II获得了一个PCR产物，并 进行了表征。
[0200] 使用Invi化ogen ZeroBlimt敏TQPO⑥PCR克隆试剂盒并根据制造商的使用说 明，将包含新型启动子的PCR产物克隆到Topo?载体中。提供了一幅载体图来显示包含新型 启动子PCR产物的克隆质粒。质粒PDAB105713对应于玉米栽培种化-IK图2)。
[0201]
[0202] 克隆之后，使用本领域技术人员已知的方法对含有PCR产物的启动子插入物进行 测序。将玉米栽培种化-II的各启动子多核巧酸序列（图4)计算比对，随后分析它们与玉米 栽培种B73邮i-1对照序列（图3)的序列同源性。序列同源性分析使用本领域技术人员已知 的生物信息学方法和/或软件程序，例如Clus化1W或Sequencher来执行。
[0203] 实施例2:新启动子表征
[0204] 序列同源性分析（图3-7)，包括与玉米栽培种B73 Ubi-1对照序列（SEQ ID N0:1; 图3)的序列比对和比较，显示了一个供进一步表征的新化i-1启动子。还观察到运个获自玉 米栽培种化-II的新化i-1启动子序列（SEQ ID N0:2;图4)包括S个不同区域的多核巧酸序 列：1)上游启动子区（SEQ ID N0:4)，2)5'-UTR(SEQ ID N0:6)，和3)内含子（SEQ ID N0:8)。 分析了来自玉米栽培种化-n的启动子区和特异性启动子元件与玉米栽培种B73 Ubi-1对 照序列的序列同源性（图5-7)。更具体地，进行序列比对来独立地比较玉米栽培种化-II启 动子的上游启动子、5'-UTR和内含子区，W及TATA框和热休克元件化SE)调节元件与玉米栽 培种B73化i-1对照序列的相应区域(图5-7,表2)。
[0205]
[0206] 图5显示了玉米栽培种化-II启动子的上游启动子区与玉米栽培种B73 Ubi-1对照 启动子序列的上游启动子区的序列比对。图6显示了玉米栽培种化-n启动子的5'-UTR或前 导序列与玉米栽培种B73 Ubi-1对照启动子序列的5'-UTR或前导序列的序列比对。图7显示 了玉米栽培种化-II启动子的内含子区与玉米栽培种B73 Ubi-1对照启动子序列的内含子 序列的序列比对。
[0207] 从玉米栽培种化-II得到的启动子元件与玉米栽培种B73 Ubi-1序列显示94.7% 的总体序列同一性(表2)。来自玉米栽培种化-II的新型启动子序列的特征确认，通常在功 能性启动子中发现的大多数启动子调节元件（即，TATA框或热休克元件)在玉米栽培种化- II启动子的核屯、启动子区域内也是高度保守的（表2)。例如，图5显示了高度保守的TATA框 (碱基对861-873,用斜体和下划线显示），它被鉴定并被发现定位在新型玉米栽培种化-II Ubi-1启动子的上游启动子区的TSS 5'上游大约50bp处。类似地，图5显示了两个重叠的热 休克元件化SE)序列(分别为碱基对454-781，用下划线显示，和479-498,用双下划线显示）， 它们在本项研究分析的新型玉米栽培种化-II Ubi-1启动子中是相当保守的，并且位于TSS 5'上游大约2(K)bp处。
[0208] 新型玉米栽培种化-II化i-1启动子的5'-UTR或前导序列中仅观察到低水平的变 化，其与玉米栽培种B73 Ubi-1对照序列具有98.8%的同一性（图6)，但是在上游启动子区 (图5)和内含子区（图7)中也鉴定了序列保守性较低的区域。例如，位于玉米栽培种化-II Ub i -1启动子的上游启动子区中的一个1 Obp启动子调控元件(碱基对90-100，下划线表示） 不是保守的（图5)。实际上，玉米栽培种化-II启动子中大多数的序列变化是专口由上游启 动子序列和内含子序列贡献的，运两者与玉米栽培种B73 Ubi-1上游启动子和内含子区域 显示的序列相似性分别仅为93.3%和95.4% (图5和7，表2)。
[0209] 此外，在延伸到TSS 5'上游100-2(K)bp的玉米化i-1上游启动子区内存在更多的调 苄基序。运些基序与转录因子结合，运些转录因子与转录起始复合体相互作用并易化其组 装，提高其稳定性，或一旦转录机构开始工作，增加启动子脱离的效率（PEREMARTI et al.2010)。因此，运个调节区域内的缺失、取代和错配会潜在影响启动子的强度和特异性。
[0210] 实施例3:使用新型启动子用于基因表达的载体构建
[0211] 除非另外指出，否则运个实施例和后续实施例中描述的分子生物学和生物化学操 作通过标准方法实施，例如在Ausubel et al.(1995)和Sambrook et al.(1989)及其更新 版本中公开的。本实验中使用的构建体在下面有更详细的描述(表3)。
[0212] 从玉米物种的化i-1基因提取包含如前所述上游启动子、5'-UTR和内含子区的玉 米启动子，并且PCR扩增子使用QIAquick凝胶提取试剂盒愈（Qiagen Ca;rlsbad，CA)进行凝 胶纯化。然后使用本领域已知的标准克隆技术将启动子多核巧酸序列克隆到Gateway入口 载体⑧（Invitrogen)中。通过限制性消化和测序进行确认所得的Gateway入口载体猿包括 玉米栽培种化-II的化i-1启动子序列。将包括玉米栽培种B73 Ubi-1启动子序列的对照入 口载体也使用本领域的标准克隆技术克隆到Gateway入口载体中。
[0213] 除了师i-1启动子序列之外，入口载体还包括来自杯水母物种的黄色巧光蛋白报 告基因（PhiYFP;aiagin, D.A.，（2004)M〇1 Biol Evol. 21; 841-50)，在其序列中纳入了ST- LS1 内含子(Vancann巧t，G.，（ 1990)M〇1 Gen Genet. 220; 245-50)，和玉米过氧化物酶5基因 (ZmPer5;美国专利6，699，984)的3 ' -UTR区。提供了显示包含每一个启动子序列的克隆入口 载体的载体图。构建体PDAB105742对应于包含玉米栽培种B73 Ubi-1启动子序列的对照入 口载体。构建体PDAB105740对应于包含玉米栽培种化-II Ubi-1启动子序列的对照入口载 体。运样，建立了包含玉米化i-1启动子、PhiYFP基因和ZmPe巧3'-UTR的基因表达盒的入口 载体。
[0214] 如表3所示，构建了二元表达载体构建体，其包括受所述新启动子序列驱动并W ZmPe巧3'-UTR终止的曲巧FP报告基因。使用标准目的二元载体PDAB101917和包含如上所 述的基因表达盒的入口载体通过使用标准克隆方法和G劝eway够重组反应构建了用于± 壤杆菌介导的玉米胚转化的转化或表达载体。
[021引二元目的载体PDAB101917包括除草剂耐受基因，草胺麟乙酷转移酶（PAT; Wehrmann et al., 1996,Nature Biotechnology 14:1274-1278)。在pDAB101917载体中， PAT基因的表达受到玉米化i-1启动子、5'-UTR和内含子的控制。该PDAB101917载体还包括 来自玉米脂肪酶基因（ZmLip;美国专利7，179，902)的3 ' -UTR区。该ZmLip 3 ' -UTR用于终止 PAT mRNA的转录。该Gateway货重组反应能够将每个包含基因表达盒（即玉米栽培种化-II 或玉米栽培种B73 Ubi-1启动子、PhiYFP基因和ZmPer5 3'-UTR)的入口载体插入到 pDAB 101917目的二元载体中。入口载体被插入在pDAB 101917目的载体内T-DNA边界A和B之 间，并位于PAT表达盒的上游。
[0216]
[0217]提供了显示二元表达载体PDAB101917的载体图，其具有基因表达盒，该表达盒包 括纳入的玉米Ubi-1启动子、PhiYFP基因和Zm化巧3'-UTR。对照构建体PDAB105748对应于 包含玉米栽培种B73 Ubi-1启动子的基因表达盒（图8)。此外，构建体PDAB105746对应于包 含玉米栽培种化-II化i-1启动子序列（图9)的基因表达盒。
[021引实施例4:植物转化
[0219] 使用本领域已知的标准转化技术将二元载体构建体，pDAB105748(玉米栽培种 B73)和PDAB105746(玉米栽培种化-II)，各自转化进入根癌±壤杆菌菌株EHA101中。分离细 菌菌落，并提取二元质粒DNA，纯化，并通过限制酶消化进行确认。
[0220] 玉米植物的转化根据Vega et al.，2008，Plant Cell Rep 27:297-305中描述的 方案进行，采用±壤杆菌介导的转化和麟丝菌素乙酷转移酶基因（PAT;Wehrmann et al.， 1996,化1:ure Biotechnology 14:1274-1278)作为选择性植物标志物。使用包含二元载体 构建体(如上所述）的根癌±壤杆菌培养物转化玉米栽培种化-II植物，产生了第一轮To转 基因玉米事件。在转化2.5个月之后，产生、制备并收获了未成熟的合子胚。
【主权项】
1. 一种基因表达盒，其包括与转基因可操作连接的启动子，其中该启动子包括与SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性的多核苷酸。2. 权利要求1的基因表达盒，其中该启动子在严格条件下与如下所述的多核苷酸探针 杂交:该多核苷酸探针包含与SEQ ID NO:2的互补物的至少90%的序列同一性。3. 权利要求1的基因表达盒，其中该可操作连接的转基因编码多肽或小RNA。4. 权利要求1的基因表达盒，其中该转基因选自下组:杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受 性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、和 选择标志物转基因。5. 权利要求1的基因表达盒，其进一步包括3 非翻译区。6. -种重组载体，其包括权利要求1的基因表达盒。7. 权利要求6的重组载体，其中该载体选自下组:质粒、粘粒、细菌人工染色体、病毒、和 噬菌体。8. -种转基因细胞，其包括权利要求1的基因表达盒。9. 权利要求8的转基因细胞，其中该转基因细胞是转基因植物细胞。10. -种转基因植物，其包括权利要求9的转基因植物细胞。11. 权利要求10的转基因植物，其中该转基因植物是单子叶植物或双子叶植物。12. 权利要求11的转基因植物，其中该单子叶植物选自下组:玉米植物，水稻植物，和小 麦植物。13. 来自权利要求10的转基因植物的转基因种子。14. 一种转基因细胞，其包含与SEQ ID N0:2具有至少90%序列同一性的合成多核苷 酸。15. 权利要求14的转基因细胞，其中该合成多核苷酸在严格条件下与如下所述的多核 苷酸探针杂交:该多核苷酸探针与SEQ ID NO:2的互补物包含至少90%的序列同一性。16. 权利要求14的转基因细胞，其中该转基因细胞是转基因植物细胞。17. 权利要求16的转基因细胞，其中该转基因植物细胞是通过植物转化方法产生的。18. 权利要求17的转基因细胞，其中该植物转化方法选自下组：土壤杆菌介导的转化 法，生物射弹转化法，碳化硅转化法，原生质体转化法和脂质体转化法。19. 一种转基因植物，其包括权利要求14的转基因植物细胞。20. 权利要求19的转基因植物，其中该转基因植物是单子叶植物。21. 权利要求20的转基因植物，其中该单子叶植物选自下组:玉米植物，水稻植物，和小 麦植物。22. 来自权利要求21的转基因植物的转基因种子。23. -种重组载体，其包括权利要求14的基因表达盒。24. 权利要求23的重组载体，其中该载体选自下组:质粒、粘粒、细菌人工染色体、病毒 和噬菌体。25. -种用于在转基因植物中表达异源编码序列的方法，该方法包括： a) 用含有如下所述的多核苷酸序列的基因表达盒转化植物细胞:该多核苷酸序列包含 与异源编码序列可操作连接的SEQ ID N0:2,该异源编码序列与3'非翻译区可操作连接； b) 分离包含该基因表达盒的转化植物细胞； C)将该转化植物细胞再生成转基因植物;和 d)获得该转基因植物，其中该转基因植物包括所述含有包含SEQ ID NO: 2的多核苷酸 序列的基因表达盒。26. 权利要求25的方法，其中该异源编码序列选自下组:杀虫剂抗性编码序列、除草剂 抗性编码序列、氮利用效率编码序列、水分利用效率编码序列、营养品质编码序列、DNA结合 编码序列、和选择标志物编码序列。27. 权利要求25的方法，其中转化植物细胞是植物转化方法。28. 权利要求27的方法，其中该植物转化方法选自下组:土壤杆菌介导的转化法，生物 射弹转化法，碳化硅转化法，原生质体转化法和脂质体转化法。29. 权利要求25的方法，其中该转基因植物是单子叶植物或双子叶转基因植物。30. 权利要求29的方法，其中该单子叶转基因植物选自下组:玉米植物，小麦植物，和水 稻植物。31. 来自权利要求25的转基因植物的转基因种子。32. 权利要求25的方法，其中该异源编码序列在转基因植物组织中表达。33. 权利要求25的方法，其中该转基因植物组织是转基因植物根、芽、茎或花粉组织。34. -种用于分离包含与SEQ ID NO: 2的至少90%序列同一性的多核苷酸序列的方法， 该方法包括： a) 鉴定包含与SEQ ID的至少90%序列同一性的多核苷酸序列； b) 产生多个寡核苷酸引物序列，其中该寡核苷酸引物序列能结合包含与SEQ ID的至少 90 %序列同一性的多核苷酸序列； c) 用选自该多个寡核苷酸引物序列的寡核苷酸引物序列从DNA样品扩增包含与SEQ ID 的至少90%序列同一性的多核苷酸序列;和 d) 分离包含与SEQ ID的至少90%序列同一性的多核苷酸序列。35. 权利要求34的方法，其中该包含与SEQ ID N0:2的至少90%序列同一性的分离多核 苷酸序列与转基因可操作连接。36. 权利要求35的方法，其中该可操作连接的转基因编码多肽或小RNA。37. -种纯化的多核苷酸序列，其包含与SEQ ID N0:2的至少90%的序列同一性，其中 该纯化的多核苷酸序列促进转基因的表达。38. 权利要求37的纯化多核苷酸序列，其中包含与SEQ ID NO: 2的至少90%序列同一性 的多核苷酸探针序列在严格条件下与权利要求37的纯化多核苷酸序列杂交。39. 权利要求37的纯化多核苷酸序列，其中该纯化多核苷酸序列与转基因可操作连接。40. 权利要求39的可操作连接的转基因，其中该可操作连接的转基因编码多肽。41. 一种基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的权利要求37的纯化多核苷酸序列， 所述转基因与3 非翻译区可操作连接。42. 权利要求41的基因表达盒，其中该转基因选自下组:杀虫剂抗性转基因、除草剂抗 性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合蛋白转基 因、和选择标志物转基因。43. -种重组载体，其包括权利要求41的基因表达盒。44. 权利要求43的重组载体，其中该载体选自下组:质粒载体、粘粒载体、和BAC载体。45. -种转基因细胞，其包括权利要求37的纯化多核苷酸序列。46. 权利要求45的转基因细胞，其中该转基因细胞是转基因植物细胞。47. -种转基因植物，其包括权利要求46的转基因植物细胞。48. 权利要求47的转基因植物，其中该转基因植物是单子叶植物。49. 权利要求48的转基因植物，其中该单子叶植物选自下组:玉米植物，小麦植物，和水 稻植物。50. 来自权利要求49的转基因植物的转基因种子。
【文档编号】C12N15/00GK106062189SQ201480076574
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2014年12月31日
【发明人】S·库马尔, M·古普塔, T·R·赖特, S·M·杰恩, D·A·史密斯, D·阿拉贝德
【申请人】美国陶氏益农公司