具有改进的产生l?赖氨酸的能力的棒状杆菌属微生物和用于使用其产生l?赖氨酸的方法
【专利摘要】提供了具有改进的产生赖氨酸的能力、其中隔膜形成起始蛋白失活的棒状杆菌微生物，和用于使用该微生物产生L?赖氨酸的方法。KCCM11454P20130927
【专利说明】具有改进的产生L-赖氨酸的能力的棒状杆菌属微生物和用于 使用其产生L-赖氨酸的方法 发明领域
[0001] 本公开设及具有改进的产生k赖氨酸的能力的棒状杆菌微生物和用于使用其产 生心赖氨酸的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物是革兰氏阳性细菌且广泛用于生产心氨 基酸。k氨基酸，特别是心赖氨酸，用在动物饲料、用于人的药物和化妆品领域中，并且通过 使用棒状杆菌菌株发酵产生。
[0004] 已经多次尝试改进使用棒状杆菌菌株产生k氨基酸的方法。在尝试中，研究了通 过使用重组DNA技术破坏或减弱特定基因的表达来改进产生心氨基酸的棒状杆菌菌株。另 夕h关于扩增与每种心氨基酸的生物合成有关的基因对k氨基酸生产的影响和关于产生心 氨基酸的棒状杆菌菌株的改进进行了大量研究。此外，甚至可W引入源自其他细菌的外源 基因。
[0005] 然而，仍然需要超出常规方法的具有改进的产生心赖氨酸的能力的菌株。
[0006] 发明详述
[0007] 技术问题
[000引一个方面提供棒状杆菌微生物，其具有改进的产生心赖氨酸的能力。
[0009]另一个方面提供用于使用该棒状杆菌微生物产生心赖氨酸的方法。
[0010]技术方案
[0011] -个方面提供具有改进的产生心赖氨酸的能力的棒状杆菌微生物，其中隔膜形成 起始蛋白（septum formation initiator protein)是失活的。
[0012] 术语"隔膜形成起始子（initiator)"如本文使用的指启动隔膜（即在棒状杆菌微 生物的细胞分裂过程期间分开细胞内部的膜结构）的形成必需的因子。细胞分裂可W在存 在隔膜形成起始子的情况下进行。在存在隔膜形成起始子的情况下，隔膜可W被缩入细胞 中屯、周围的外周部分W将细胞质一分为二。之后可W进行外部膜的合成，继之W细胞分裂。 隔膜形成起始蛋白可W是选自表1和2的一种蛋白。
[0013] [表 1]
[0014]
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[0018] 隔膜形成起始子可W包括丝状溫度敏感性（Fts)蛋白。Fts蛋白是设及分裂体 (divisome)形成的蛋白，其在微生物的细胞分裂过程中可能是必要的。Fts蛋白可包括 FtsB、FtsA、FtsZ、FtsEX、FtsK、FtsQ、FtsW、FtsI、或其组合，具体地，FtsB。FtsB可W具有沈Q ID NO: 1的氨基酸序列或其70%同源性，具体地，其80%同源性，更具体地，其90%同源性， 最具体地，其95 %同源性序列。术语"同源性"指两个氨基酸序列之间的同一性程度，其可通 过使用W下方法来确定，该方法利用BLAST 2.0来计算参数如得分、同一性或相似性，运是 本领域普通技术人员广泛公知的。
[0019] 编码Fts蛋白的基因可W是编码的34，打38，的32，的36乂，的31(，的39，打3胖，的31或 其组合的核酸。
[0020] 设及棒状杆菌微生物的细胞分裂的f tsB基因可W与f tsZ，f tsEX，f tsK，f tsQ，f tsW 和B类高分子量(HMW)-PBP-样好地形成分裂体。ftsB基因可W是编码SEQ ID N0:1的氨基 酸序列的核酸。ftsB基因可W是例如NCBI登录号NCgl0936基因。术语"NCBI登录号NCgl0936 基因"指具有源自谷氨酸棒状杆菌菌株的SEQ ID N0:2的核巧酸序列的基因。另外，基因可 W存在于棒状杆菌属的微生物中并产生与NCBI登录号NCgl0936基因产生的产物实质相同 的产物。表述"实质相同"如本文使用的意指与NCBI登录号NCgl0936基因的产物有相同活性 和调控机制。
[0021] 术语"失活"如本文使用的意指细胞或酶的活性水平不显现(nonexMbition)，运 可在与其可比的同一类型的细胞或初始酶中测量。与其可比的同一类型的细胞可W是未被 操作如重组或修饰的细胞。在微生物中，隔膜形成起始蛋白的失活可W指去除多肤的活性， 该多肤编码所述隔膜形成起始子。此外，在微生物中，可W使隔膜形成起始蛋白失活至足W 产生心赖氨酸的程度。
[0022] 失活可W通过重组方法导致。重组方法可包括同源重组方法。同源重组方法可W 通过W下进行:将包含基因的序列部分的载体转化到微生物，并在存在选择标志物的产物 的情况下培养该微生物，由此基因的序列部分和微生物中的内源基因可经历同源同组。载 体可W是pDZ-AftsB W140*载体，其包含由SEQ ID N0:4代表的NCBI登录号NCgl0936基因 片段，或pDZ-ftsBW140*载体，其包含由沈Q ID N0:6代表的NCBI登录号NCgl0936基因片段。 通过同源重组，微生物中的内源基因可W重组，且从重组的基因中，可通过选择标志物选择 包含标志物的重组体。通过同源重组方法，可W获得棒状杆菌属的微生物，其中内源NCBI登 录号NCgl0936基因失活。
[0023] 在微生物中，蛋白活性的失活可由基因的碱基、核巧、核巧酸或其组合的缺失、取 代、添加、倒置、或其组合产生。详细而言，使蛋白活性失活的方法的例子可W是基因敲除办 法、反义技术或RNAi技术。使蛋白活性失活的方法可进一步包括每个基因的初始拷贝的缺 失、将初始拷贝用突变体取代、或从弱启动子表达初始拷贝。另外，还可W利用编码蛋白的 基因的启动子的取代，通过随机或定点诱变的突变转移，或基因破坏或敲除。此外，还可W 使用通过基因修饰将不稳定元件引入mRNA或异常化(abe;rrating)RNA的核糖体结合位点 (RBS)的方法。
[0024] 基因的失活可通过W下实现:将包含NCBI登录号NCgl0936基因的部分和选择标志 物的载体转化到棒状杆菌属的微生物，接着在存在抗生素的情况下培养并选择。
[0025] 选择标志物可用于选择用载体转化的细胞。选择标志物可W是赋予可选择表型， 如药物抗性、营养缺陷、细胞毒性药物抗性或表面蛋白表达的标志物。
[0026] 棒状杆菌微生物可W选自下组：谷氨酸棒状杆菌、产氨棒状杆菌 (CoiTnebacterium ammoniagenes)、假结核棒状杆菌、有效棒状杆菌、Corynebacterium pseudogenitalium、Corynebacte;rium genitalium、拥挤棒状杆菌、无枝菌酸棒状杆菌、马 氏棒状杆菌、Corynebacterium casei、Corynebacter ium 1 ipophi lof lavum、 Corynebacterium tuberculostearicum、杰氏棒状杆菌、稍变棒状杆菌，和从其野生型产生 的心赖氨酸生产性突变体。具体地，所述棒状杆菌微生物可W是谷氨酸棒状杆菌。谷氨酸棒 状杆菌可W是具有登录号KCCM11016P，KCCM10770P，KCCM11347P，或CJ3P的谷氨酸棒状杆 困。
[0027] 术语"棒状杆菌微生物"如本文使用的指具有产生k赖氨酸的能力的棒状杆菌属 的微生物。棒状杆菌微生物的例子可包括具有改进的产生心赖氨酸的能力的棒状杆菌属的 微生物，对其引入了突变W使编码隔膜形成起始蛋白的基因失活W用于改进产生k赖氨酸 的能力。表述"具有产生k赖氨酸的能力"意为，当在培养基中培养微生物时，微生物具有产 生和在培养基中分泌k赖氨酸的能力。所述棒状杆菌微生物可W是W下微生物，与其野生 型或亲本菌株相比，其可在培养基中W大量产生和积累心赖氨酸。
[0028] 根据一个实施方案，使编码棒状杆菌微生物中隔膜形成起始蛋白，例如FtsB的基 因失活，由此可W抑制棒状杆菌微生物的细胞分裂，同时可W相对改进产生k赖氨酸的能 力。
[0029] 另一个方面提供用于产生k赖氨酸的方法，该方法包括培养根据本发明的微生物 从而在培养基中产生心赖氨酸；和从所述微生物或培养基回收心赖氨酸。所述微生物与上 文的描述相同。
[0030] 微生物的培养可在适当培养基中在本领域公知的培养条件下实施。此类培养过程 可W随着要选择的微生物容易地调整。培养方法可包括选自下组的至少一种:分批培养、连 续培养和补料分批培养。
[0031] 培养中使用的培养基可W满足具体微生物的要求。培养基可选自下组:碳源、氮 源、微量元素及其组合。
[0032] 碳源可W选自下组:碳水化合物、脂质、脂肪酸、醇、有机酸及其组合。碳水化合物 可W是葡萄糖、薦糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素或其组合。脂质可W是大豆油、向日 葵油、藍麻油、挪子油或其组合。脂肪酸可W是栋桐酸、硬脂酸、亚油酸或其组合。醇可W是 甘油或乙醇。有机酸可W包括乙酸。
[0033] 氮源可W包括有机氮源、无机氮源、或其组合。有机氮源可W选自下组:腺、酵母提 取物、肉膏、麦芽抽提物、玉米浸溃液korn ste邱liquid,C化）、大豆粉(soybean meal)及 其组合。无机氮源可W选自下组:尿素、硫酸锭、氯化锭、憐酸锭、碳酸锭、硝酸锭及其组合。
[0034] 培养基可W包含选自下组的一种:憐、金属盐、氨基酸、维生素、前体及其组合。憐 源可W包括憐酸二氨钟、憐酸氨二钟(dipotassium phosphate)、其相应的含钢盐。金属盐 可W是硫酸儀和硫酸亚铁（iron suKate)。
[0035] 可W将培养基或个别组分W分批模式、连续模式、或补料-分批模式添加到培养 基。
[0036] 在培养方法中，可W调节培养物的pH。可W通过对培养物添加氨氧化锭、氨氧化 钟、氨水(ammonia)、憐酸或硫酸实施P的周节。此外，培养方法可W包括防止气泡产生。可W 通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。消泡剂可W包括脂肪酸聚乙二醇醋（fatty acid polyglycol ester)。此外，培养方法可W包括将气体注射入培养物中。气体可W包括能够 维持培养物的需氧条件的任何气体。气体可W是氧气或含氧气体。含氧气体可W包括空气。 在培养中，培养物的溫度可W在20至45°C，例如22至42°C或25至40°C的范围中。可W继续培 养，直到k赖氨酸的生产达到期望的水平。
[0037] 在根据本发明的方法中，培养可W是连续培养或分批培养，如分批、补料-分批和 重复的补料-分批培养。此类培养方法是本领域公知的，且可W使用任何适宜的方法。可W 通过阴离子交换层析和巧=酬衍生化来分离和分析心氨基酸。
[0038] 本申请的有利效果
[0039] 根据一个方面的编码隔膜形成起始蛋白的基因失活的微生物，可W改进该微生物 的生产心赖氨酸的能力。
[0040] 根据一个方面的用于生产k赖氨酸的方法，可高生产力(productivity)生产 心赖氨酸。 实施例
[0041] 在下文中，本申请会参考实施例更为详细地描述。然而，运些实施例仅仅用于例示 目的，并且本申请的范围并不意图受限于运些实施例。
[0042] 实施例1:通过缺失制备ftsB基因失活的重组载体
[0043] 基于美国国家卫生研究院的GenBank(NIH Genbank)中的碱基序列获得ftsB基因 的核巧酸序列（SEQ ID N0:2)。为了制备其中ftsB的开放阅读框内部消失的基因片段，基于 569 10側:2，构建了引物0936尸1，09369尺1，0936尸2，和0936尺2并分别称为569 10側:7至 10。
[0044] 为了制备由于ftsB基因缺失所致的失活重组载体，使用pDZ载体(参见韩国专利登 记号10-0924065)。然后，如上文描述的，将具有ftsB基因的经修饰序列的构建用于失活的 核酸分子插入pDZ载体的多克隆位点中，从而制备包含SEQ ID N0:4的核酸序列的pDZ-A ftsB载体。沈Q ID N0:4的核酸序列编码具有SEQ ID N0:3的序列的氨基酸序列。
[0045] 使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA作为模板和使用引物0936F1-0936R1和 0936F2-0936R2来实施PCR。使用Pf山Jltra?高保真DNA聚合酶（Stratagene)作为聚合酶。PCR 条件如下:在96 °C变性30秒，在58 °C退火30秒，在72 °C聚合2分钟，30个循环。
[0046] 因此，获得一对ftsB-A和ftsB-B DNA片段，各自分别包含74bp和95bp的ftsB基因。 使用Infusion克隆试剂盒（Invitrogen)将扩增的产物克隆到pDZ载体中，引起pDZ- A ftsB 载体的构建。pDZ-AftsB载体包含13加p ftsB的Xbal末端和没有ftsB的408bp内部区的片 段两者。
[0047] 实施例2:通过引入终止密码子来制备ftsB基因失活的重组载体
[004引为了通过引入终止密码子来制备ftsB基因失活的重组载体，使用pDZ载体，并构建 引物来将ftsB基因开放阅读框中第140位氨基酸（即色氨酸）的反密码子取代为终止密码 子。使用引物对0936F1和0936R3和引物对0936F3和0936R2，W与实施例相同的方式来实施 用于扩增的PCR，并将扩增产物克隆到pDZ载体中，引起pDZ-ftsB W140*载体的构建。引物对 0936F3和0936R3的序列分别如SEQ ID N0:ll和12所示。克隆到构建的载体中的fts基因的 氨基酸序列为SEQ ID NO:5,且其核酸序列为SEQ ID NO:6(核巧酸序列）。
[0049] 实施例3:构建ftsB基因失活的菌株
[0050] 通过电脉冲方法将k赖氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P((旧）登录号 KFCC10881，参见韩国专利登记号10-0159812和10-0397322)用实施例1和2中构建的重组载 体转化(使用Appl.Microbiol.Biotechnol. (1999)52:541-545的转化方法）。然后，从含有 25mg/L卡那霉素的选择培养基中选出具有通过基因同源性在染色体上插入的祀基因的菌 株。载体在染色体中的成功插入通过观察菌落在含有X-gal(5-漠-4-氯-3-吗I噪基-0-D-半 乳糖巧）的固体培养基上是否是蓝色来确认。将染色体有插入的初步菌株在营养培养基中 振摇培养(在溫度30°C8小时），然后将其从1(T4稀释为1(TW，接着在含有X-gal的固体培养基 上涂布。虽然大多数菌落为蓝色，但有一些菌落是白色。选择那些低比率的白色菌落，其进 一步用于选择其中ftsB基因通过二次交叉(secondaiy crossover)被失活的菌株。
[0051 ]为了选出其中ftsB基因通过缺失被失活的菌株，将一对基因特异性引物SEQ ID ^:7和569 10^:10,0936。1-093632用作引物来实施?〔1?。分析关于祀位点的碱基序列用 于最终确认，从而引起失活的菌株KCCM11016P- A f tsB的构建，其由f tsB基因的缺失所致。 为了选出其中由于经修饰的终止密码子的转移导致ftsB基因失活的菌株，将一对引物SEQ ID N0:7和SEQ ID ^:10,0936。1-093632用作引物来实施?〇?。分析关于祀位点的碱基序列 用于最终确认，从而引起f tsB基因失活的菌株KCCM11016P-f tsBWHO*的构建，其由终止密 码子的引入所致。
[0052] 为了检查在属于谷氨酸棒状杆菌属的其他菌株中的效果，使用KCCM10770P(参见 韩国专利登记号10-0924065)，KCCM11347P(参见韩国专利登记号10-1994-0001307)和CJ3P (Binder et al.Genome Biology 2012,13:R40)作为亲本菌株，W与上文方法中相同的方 式构建ftsB基因缺失的菌株和引入终止密码子的菌株，即KCCM10770P- A ftsB， KCCM11016P-ftsB W140*,KCCM11347P-AftsB,KCCM11347P-ftsB WHO*,CJ3P-A ftsB, CJ3P-ftsBW140水。
[0053] 实施例4:ftsB基因失活的菌株中的k赖氨酸生产
[0054] 培养实施例巧巾构建的レ赖氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P-A ftsB, KCCM11016P-ftsB W140*,KCCM10770P-AftsB,KCCM10770P-ftsB WHO* ,KCCM11347P-A f tsB，KCCM1 l：M7P-f tsB W140，CJ3P- A f tsB，和CJ3P-ftsB WHO*用于k赖氨酸产生，如在 W下方法中的。
[005日]将谷氨酸棒状杆菌亲本菌株和KCCM11016P-AftsB，KCCM11016P-ftsBW140*， KCCM10770P-AftsB，KCCM10770P-ftsB W140*，KCCM11347P-AftsB，KCCM11347P-ftsB WHO*，CJ3P- A f tsB，和CJ3P-f tsBWHO*各自接种到含有25ml种子培养基的250mlS角振荡 烧瓶（corner-baffled flask)中，然后W200次旋转每分钟(rpm)在30°C摇动培养20小时。 然后，将1ml的每种种子培养物接种入含有24ml生产培养基的250mlS角振荡烧瓶中，接着 通过W20化pm在30°C摇动培养120小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。
[0化6] 种子培养基(pH 7.0)
[0057] 20g 粗糖、lOg 腺（pepton)、5g 酵母提取物、1.5g 尿素、4g K 出 P〇4、8gK2 册 〇4、0.5g MgS〇4 ? 7出0、1 OOiig生物素、1，OOOiig硫胺素HC1、2，OOOiig泛酸巧、2，OOOiig烟酷胺（基于1L蒸 馈水）
[0化引生产培养基(pH 7.0)
[0059] 100g葡萄糖、40g(NH4)2S04、2.5g大豆蛋白、5g玉米浸溃固体、3g尿素、lgK此P04、 0.5g MgS〇4 ? 7出OaOOiig生物素、l，000iig盐酸硫胺素、2,000iig泛酸巧、3,000iig烟酷胺、30g 化C〇3(基于1L蒸馈水）
[0060] 在完成培养后，通过使用HPLC的方法来测量k赖氨酸生产。k赖氨酸在谷氨酸棒 状杆菌亲本菌株和KCCM11016P-AftsB，KCCM11016P-ftsBW140*，KCCM10770P-AftsB, KCCM10770P-ftsB W140*，KCCM11347P-A ftsB，KCCMl1347P-ftsB W140，CJ3P-A ftsB，和 CJ3P-ftsBW140*的培养溶液中的浓度显示于表3。显示于表3的结果是通过重复实验的平均 值。
[0061][表 3]
[00621
[
[0064] 如表3中显示的，当ftsB基因缺失或终止密码子引入亲本菌株KCCM11016P中时，赖 氨酸生产在它们所有之中增加了约4%。运些结果表明赖氨酸浓度增加不是通过ftsB基因 本身的结构变化，而是通过作为隔膜形成起始子的FtsB蛋白的缺失。另外，来自其他亲本菌 株KCCM10770P，KCCM11347P和CJ3P的FtsB失活菌株的赖氨酸浓度增加了约4%，如与具有野 生型FtsB活性的亲本菌株相比的。在另一方面，FtsB失活菌株的细胞体积降低了约5%，如 与亲本菌株相比的。该结果意味着可W通过控制菌株的量来改进生产赖氨酸的能力，运是 由于对赖氨酸生产菌株的细胞分裂的抑制所致。KCCM11016P-ftsB W140*(CA01-2274)在 2013年9月27日W保藏号KCCM11454P保藏在位于韩国首尔Urim bd.，Hongje-1-dong, Seodaemun-gu的韩国微生物保藏中屯、。
[0065] 保藏机构:韩国微生物保藏中屯、（国际）
[0066] 保藏号:KCCM 11454P
[0067] 保藏日期:2013年9月27日
【主权项】
1. 一种具有改进的产生L-赖氨酸的能力的棒状杆菌微生物，其中隔膜形成起始蛋白失 活。2. 根据权利要求1的微生物，其中所述隔膜形成起始蛋白具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序 列。3. 根据权利要求1的微生物，其中所述棒状杆菌微生物是谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)。4. 一种用于产生L-赖氨酸的方法，所述方法包括： 培养权利要求1的微生物以在培养基中产生L-赖氨酸;和 从所述微生物或所述培养基回收L-赖氨酸。
【文档编号】C12R1/15GK106062177SQ201480067603
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2014年12月8日
【发明人】文准玉, 朴相喜, 许兰, 李光镐
【申请人】Cj第制糖株式会社, Cj第一制糖株式会社