花生AhWRI-1启动子及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程和生物技术领域，具体涉及一种花生AP2/EREBP类转录 因子AhWRI-Ι基因启动子，同时还涉及一种花生启动子PAhWRIi的制备方法及其在植物基因 工程中的应用。
【背景技术】
[0002] 通过转基因手段进行作物品种的选育，其优势在于转基因不受生物体亲缘关系的 限制，理论上讲，用于转化的基因可以来源于任何物种或人工合成的基因。2014年全球转基 因植物种植面积达到1. 8亿公顷，年增长率在3% -4%之间，目前转基因技术已成为植物品 种改良的重要手段。
[0003] 在植物转基因中有两个必需元件，分别是启动子和基因。启动子是生物体内的一 段DNA片段，是位于基因转录起始位点上游的顺式调控序列，与反式作用的识别因子结合， 通过RNA聚合酶同反式作用因子相互作用，启动基因的转录。它是调控基因表达过程中的 重要因子，其决定了动植物在发育过程中基因表达的空间、时间及表达强度的特异性。按照 作用方式和功能，启动子可分为组成型、特异性和诱导性启动子，在某些情况下一类启动子 也会兼有其它类型启动子的特性。
[0004] 启动子在构建能够高水平表达异源表达载体的过程中起到关键作用，它决定了外 源基因的转录效率和基因的表达水平。组成型启动子驱动的外源基因在转基因植株的所 有发育时期和组织中稳定表达。对许多双子叶植物的转化，通常都使用含花椰菜花叶病毒 (CaMV)的35S启动子或胭脂氨酸合成酶nos启动子的质粒载体，而在单子叶植物转化中最 常用的是含有水稻肌动蛋白Act启动子、玉米泛素Ubi启动子及35S启动子的质粒载体。但 是很多时候外源基因在受体植物中的持续高效表达不仅造成生物体内能源的浪费，而且在 所有组织中的表达有可能对植株本身具有毒害作用，甚至引起转基因安全问题。因此，组织 特异性启动子和诱导性启动子的研究和应用日益受到育种工作者的重视。
[0005] 组织特异性启动子是指驱动的基因仅在某一特定组织或器官中表达，或者只是在 植物生长发育过程中的某一个特定阶段表达。如根特异性启动子、拟南芥叶片特异性启动 子、番茄果实特异性启动子、水稻花药特异性启动子、胚乳特异性启动子、棉花纤维特异性 启动子等。特异性启动子不仅可以使得外源基因在受体中发挥作用，而且能有效减少对植 物的不利影响。
[0006] 花生是全世界范围内广泛种植的经济和油料作物，花生果仁中含有丰富的脂肪酸 和蛋白，是重要的油脂和蛋白来源。花生油中脂肪酸主要是由不饱和脂肪酸油酸和亚油酸 构成，两者占花生油总脂肪酸含量的80%左右，是一种较为健康的食用油，在世界食用油消 费和休闲食品供应中占据重要地位。随着人民生活水平的提高，花生的营养保健功能日益 受到重视，食品加工占总产量的比例进一步增加。而随着城市化的推进，耕地面积不断减 少，这要求我们需要进一步提高花生的产量和品质。转基因技术的日益成熟为提高花生产 量和品质提供了新的途径，但是面临着转基因的安全风险。在转基因研究中使用特异性表 达的启动子是解决这一风险的可行性方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于：提供一种PAhWRIi启动子序列及其制备方法。该启动子的时空 表达模式可用于研究基因的表达形式，优点在于，来源于植物内源的组织特异性启动子能 够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因植物的特定组织或时期表达，避免造成 植物自身能源和物质的浪费，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位， 更好的发挥功能，可应用于植物基因工程研究和花生的转基因研究。
[0008] 本发明的另一个目的在于：提供一种花生PAhWRIi的制备方法，该方法通过对花生 基因组DNA进行PCR扩增，获得花生PAhWRIi启动子，该方法操作简单，结果稳定可靠。
[0009] 本发明的再一个目的在于：提供一种含有植物高效表达启动子的重组载体，其含 有所述的启动子核苷酸序列。该载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的标记基因GUS 表达强度高，容易检测。
[0010] 本发明还有一个目的在于：提供一种花生PAhWRIi启动子在种子中的应用。
[0011] 为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种分离的花生转录因子AhWRI-l基因的启动子，其序列为下列核苷酸序列之一： (a) 序列表中SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列； (b) 在严谨条件下能与（a)的DNA序列杂交并且具有相同功能的核苷酸序列； (c) 与（a)或（b)的DNA序列具有90%以上的同源性，并且具有启动子功能的核苷酸 序列。
[0012] -种花生启动子PAhWRIi的制备方法，包括以下步骤： (1) 利用SDS裂解法提取基因组DNA，所用引物为： Pahwri 1s：5;-ACGCGTCGACCCCTAACCGTTCTATCTCTTTTCTCCCAC; -3;； Pahwri1A：5 ; -CGCGGATCCCTCACCACCACCACCACCACCCTC-3;； (2) 以基因组DNA为模板，以PAhWRi#、ΡΑΜΚΙ 3为引物进行PCR扩增，反应体系为25μL， 包括：1XPCRbuffer、MgCl2 1. 5mmol/L、dNTP0· 2mmol/L、PfuTaq酶 1. 5 单位、模板 30 ~ l〇〇ng，体系中每种引物的浓度均为0· 5mol/L; 扩增过程为：95°C预变性lmin;94°C变性10s，55°C退火30s，72°C延伸2min，35个循 环；72°C延伸lOmin; (3)PCR产物经质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶检测，用凝胶回收试剂盒回收目的片 段；按目的片段、PMD18-T载体3:1的摩尔比混合，加入5个单位的T4DNA连接酶，10X反 应缓冲液2. 5μL，用无菌水补充体积至25μL，16°C连接过夜，获得连接液； (4) 用冻融法转化DH5a菌株的感受态细胞，将连接液涂布于含有氨苄青霉素50mg/L的 LB固体培养基平板上，37°C培养过夜，挑选白斑，进行菌落PCR检测，将阳性重组子接种于 含氨苄青霉素50μg/mL的LB液体培养基中，37°C200r/min振荡培养过夜，用小量碱法提 取质粒，SalI/XbaI双酶切1yg质粒，用0. 8 %的琼脂糖凝胶电泳检测；将检测正确的 阳性重组质粒克隆，将目的片段连入PMD18-T载体，获得载体pMD18-PAhWRIi，即得到所述的 PaIiWRI1 启动子。
[0013] 其中LB固体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、 log氯化钠和8g琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于lOOOmL;然后分装于500mL三角瓶中， 121°C、6. 859X104Pa下高压消毒15分钟，4°C冷藏备用。
[0014] 其中LB液体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取 物和l〇g氯化钠溶解于蒸馏水中，定容于l〇〇〇mL，然后分装于500mL三角瓶中，121 °C、 6. 859X104Pa下高压消毒15分钟，4°C冷藏备用。
[0015] -种含有AhWRI-Ι基因的启动子的重组载体。
[0016] 所述的花生AhWRI-Ι基因启动子的重组载体的构建方法，包括以下步骤： 首先用SalI/XbaI双酶切克隆载体pMD18-PAhWRIi，同时用Sall/Xbal双酶切 pBI-PAhsAD_GUS质粒；酶切反应在37°C培养箱中进行，反应4~6小时后用质量体积比为1 % 的琼脂糖胶电泳检测； 将克隆载体pMD18-PAhWRIi酶切下的3Kb的小片段和pBI-PAhsAD-GUS酶切下的10Kb的大 片段用DNA凝胶回收试剂盒回收；按3Kb的小片段、10Kb的大片段以摩尔浓度3:1的比例 混合，加入T4DNA连接酶5个单位、10X反应缓冲液2μL，用无菌水补充体积至20μL，16°C 过夜； 用冻融法转化DH5a菌株的感受态细胞，在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上筛选， 16小时后挑取正常生长的菌斑进行菌落PCR检测，挑取阳性菌落提质粒，经酶切验证对正 确的重组质粒命名为pBI-PAhWRIρ
[0017] 所述的启动子在种子中的应用。
[0018] 本发明的积极有益效果（优点）： 1、本发明的启动子的时空表达模式可用于研究基因的表达形式，优点在于，来源于植 物内源的组织特异性启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基