Cmv抗性由单隐性基因控制的辣椒材料的选育和鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蔬菜品种鉴定领域，具体涉及CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料 的选育和鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 辣椒（CapicumannuumL.)是世界范围内广泛栽培的重要蔬菜作物。黄瓜花叶 病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV)是一种毁灭性病害，是危害辣椒的主要病毒之一。 CMV常引起辣椒叶型畸形皱缩，严重时植株萎缩，果实小而发硬，导致产量下降，品质降 低。CMV可严重影响辣椒的产量和品质，一般年份可造成辣椒减产20% -30%，严重时可达 50% -60%。在栽培生产过程中为防治辣椒CMV病害而频繁施用的化学农药，已经影响到 辣椒产品的食用安全，对人体健康构成了严重威胁，也对生态环境造成了污染。实践表明， 培育抗病品种是防治病害最经济有效的方法。同时发掘辣椒种质资源的优异抗CMV基因， 对其进行分子水平的遗传解析，对于明确抗病基因作用的分子机理和抗病育种具有重要意 义。
[0003] 辣椒CMV抗性遗传规律复杂，不同的抗原材料抗病遗传模式不同。根据系列研究 报道和发明人课题组做过的遗传规律研究，绝大多数CMV抗性材料抗性表现为数量性状遗 传模式，大家纷纷针对手中的CMV抗性材料进行了QTL定位，但由于抗性材料不同或CMV毒 源不同，QTL定位结果相互间差异很大，难以比较。根据以往研究报道，仅有极少数材料CMV 抗性由单基因控制，如韩国报道Bukang的CMV抗性由单显性基因控制。然而至今，尚未有 CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料的相关研究报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料的选育和鉴定方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0006] CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的选育方法，其特征在于：该选育方 法包括以下步骤：
[0007] 杂交步骤：将四份杂交材料两两杂交，分别得到单交杂种；再将两个所述单交杂 种杂交，得到双交杂种；
[0008] 单倍体培育步骤：将所述双交杂种进行花药培养，再经过CMV人工接种抗性鉴定， 得到高抗CMV的辣椒材料Q132。
[0009] 在一种优选的实施方式中，所述杂交步骤中，四份杂交材料分别为" 37-74 "、"喜洋 洋"、"帕沃尔"、"圣保罗";将"37-74"与"喜洋洋"杂交，"帕沃尔"与"圣保罗"杂交。
[0010] 在一种优选的实施方式中，所述单倍体培育步骤中，花蕾于4°c低温预处理1-3 天。
[0011] 在一种优选的实施方式中，所述单倍体培育步骤中，将所述花药接种于N4-3培养 基；
[0012] 所述N4-3培养基为固液双层培养基，固体层包括：NTH基本培养基的基础上，添 加：质量百分比为3-6 %的蔗糖、质量百分比为0. 5 %的活性炭、质量百分比为0. 8 %的 琼脂粉；液体层包括：NTH基本培养基的基础上，添加：质量百分比为3-6%的蔗糖、IAA 0· 5-1. 5mg/L、6_BA0· 1-0. 6mg/L、戊块草胺 0· 1-0. 5mg/L，抽滤灭菌；
[0013] 示例性地，所述固体层中，所述蔗糖的质量百分比可以为3 %、4%、5 %、6 %中 任意值或任意值二者之间的范围，优选为5% ;液体层中，所述蔗糖的质量百分比可以为 3%、4%、5 %、6 %中任意值或任意值二者之间的范围，优选为5 %，所述IAA的含量可以为 0· 5mg/L、0. 8mg/L、1.Omg/L、1. 2mg/L、1. 5mg/L中任意值或任意值二者之间的范围，优选为 lmg/L;所述 6-BA的含量可以为 0·lmg/L、0. 2mg/L、0. 4mg/L、0. 5mg/L、0. 6mg/L中任意值或 任意值二者之间的范围，优选为0. 3mg/L;所述戊炔草胺的含量可以为0.Img/L、0. 2mg/L、 0· 3mg/L、0. 4mg/L、0. 5mg/L中任意值或任意值二者之间的范围，优选为0· 3mg/L。
[0014] 在一种优选的实施方式中，所述单倍体培育步骤中，所述花药培养中，所述花药先 在28-35°C条件下黑暗培养1-10天，再转移到25-28°C条件下黑暗培养4-7周。
[0015] 在一种优选的实施方式中，六联合世代群体构建步骤：以所述高抗CMV的辣椒材 料Q132、高感CMV的甜椒自交系FS871为亲本，构建PpP2、B2、F2六联合世代群体。
[0016] 接种和分析步骤：再将所述六联合世代群体进行多个季节的接种处理后，进行抗 性统计分析，得到由单隐性基因控制的辣椒材料。
[0017] 在一种优选的实施方式中，所述六联合世代群体构建步骤中，构建方法包括以下 步骤：
[0018] F# :春季，以所述高抗CMV的辣椒材料Q132为母本，高感CMV的甜椒自交系 FS871为父本进行杂交，得到匕代种子；
[0019] F2、BpB2代：同年冬季，所述Fi代自交、并分别与所述高抗CMV的辣椒材料Q132、 高感CMV的甜椒自交系FS871回交，分别获得F2、BJPB2代的种子。
[0020] 本发明的有益效果为：
[0021] 1、本发明选取市场现有的优良品种的辣椒材料，进行杂交和单倍体培育，之后进 行抗性鉴定，得到CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132 ;本发明是采用针对现有的 市场优良品种，利用反向育种的思路培育优良育种材料的方法。
[0022] 2、本发明方法简便、快捷，大大地缩短了育种时间和降低了育种成本。
【附图说明】
[0023] 图1为CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的选育方法的流程示意图。
[0024] 图2为实施例1中花药培养步骤中得到的胚状体的照片。
[0025] 图3为实施例1中再生植株培养步骤中得到的再生株的照片。
[0026] 图4为实施例1中驯化移栽步骤中得到的植株的照片。
[0027] 图5为实施例2中辣椒幼苗单株CMV病情7级的植株的照片。
[0028] 图6为实施例2中辣椒幼苗单株CMV病情5级的植株的照片。
【具体实施方式】
[0029] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。
[0030] 实施例1 :
[0031] 本实施例为CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的选育方法，包括以下步 骤，如图1所示。
[0032] (1)选取杂交材料：选取从国内外引进的四份优良辣椒杂交种："37-74"、"喜洋 洋"、"帕沃尔"、"圣保罗"。
[0033] 其中，"37-74"购自瑞克斯旺（中国）种子有限公司，"喜洋洋"购自昌乐新盛种业 有限公司，"帕沃尔"购自日本坂田种苗（苏州）有限公司，"圣保罗"购自纽内姆（北京） 种子有限公司。
[0034] (2)杂交：对上述四份杂交材料进行两两杂交："37-74"与"喜洋洋"杂交得到单交 杂种1，"帕沃尔"与"圣保罗"杂交得到单交杂种2 ;再将单交杂种1和单交杂种2杂交，得 到双交杂种。
[0035] (3)单倍体培育：将该双交杂种进行花药培养，再经过CMV人工接种抗性鉴定，得 到高抗CMV的DH株系Q132 (即为高抗CMV的辣椒材料Q132)。
[0036] ①选取花蕾：在上述双交杂种中，选择长势良好、无病虫害的植株作为供体植株， 严格按镜检结果选取小孢子发育处于单核靠边期一双核早期的花蕾。
[0037] ②花蕾预处理：4°C低温预处理花蕾1-3天。
[0038] ③花蕾消毒：取合适大小的预处理后的花蕾，剥去花萼后，先用75%的酒精浸泡 30s，再用8-10%的次氯酸钠振荡消毒10-20min，最后用无菌水清洗3次，每次3-5min，得到 消毒后的花蕾。
[0039] ④接种：取消毒后的花蕾，于超净工作台上将花药完好无损的剥离，以每60_直 径培养皿12-18枚花药的密度接种于N4-3培养基上。
[0040] 该N4-3培养基为固液双层培养基，其中，固体层包括：NTH基本培养基的基础上， 添加：质量百分比为3-6%的蔗糖、质量百分比为0.5%的活性炭、质量百分比为0.8%的琼 脂粉，于121°C高压灭菌；
[0041 ] 液体层包括：NTH基本培养基的基础上，添加：质量百分比为3-6 %的蔗糖、 ΙΑΑ0. 5-1. 5mg/L、6_BA0. 1-0. 6mg/L、戊块草胺 0· 1-0. 5mg/L，抽滤灭菌；
[0042] 该NTH基本培养基的原料包括：
[0043] 硝酸氨825mg/L，硝酸钾950mg/L，二水氯化妈166mg/L，七水硫酸镁185mg/L，磷 酸二氢钾680mg/L，硼酸6. 20mg/L，四水硫酸锰25mg/L，七水硫酸锌10mg/L，二水钼酸钠 0· 25mg/L，五水流酸铜0· 025mg/L，六水氯化钴0· 03mg/L，肌醇100mg/L，烟酸5mg/L，盐酸P比 咳醇0· 5mg/L，盐酸硫胺素0· 5mg/L，甘氨酸2mg/L，叶酸5mg/L，生物素0· 5mg/L。
[0044] ⑤花药培养：花药先在28-35°C条件下黑暗培养1-10天，再转移到25-28°C条件下 继续黑暗培养；培养4-7周时间，即可看到大量胚状体发生，如图2所示。
[0045] ⑥再生株培养：选取子叶型胚状体，转移到不加激素的MS基本培养基上，培育壮 苗，得到再生株，如图3所示。
[0046] ⑦鉴定倍性：待再生株长至3-4片真叶，切取叶片，通过流式细胞仪或保卫细胞叶 绿体计数法，从细胞染色体的水平鉴定再生株的倍性。
[0047] ⑧驯化移栽：将鉴定为二倍体的上述再生株移栽至培养土中，进行驯化培养；其 中，该培养土由蛭石和草炭按质量比1:1混合制成，并经过高压灭菌；培养条件为：光照时 间为16小时/天，强度为20001x光照，温度为22-25Γ;培养得到驯化后的二倍体再生株 (如图4所示）。
[0048] ⑨CMV人工接种抗性鉴定：
[0049] 米收上述驯化后二倍体再生株系的种子并培养长成植株，再对该植株进行CMV人 工接种抗性鉴定，以确定步骤⑦中鉴定为二倍体的再生株的CMV抗性。该抗性鉴定包括如 下步骤：
[0050] A、CMV毒源繁殖：将CMV毒源在"心叶烟"上繁殖，温度20-28°C，自然光照。
[0051] B、人工接种：约9-11天，"心叶烟"发病后，采摘发病的叶片，加入5倍于鲜病叶重 量的0. 03mol/L磷酸缓冲液（pH7. 0)，捣碎后双层纱布过滤，滤液立即用于接种于上述六世 代联合群体的辣椒幼苗；待辣椒幼苗长至2-3片真叶时，叶面撒布一薄层600目的金刚砂， 人工摩擦接种：接种2次，2-