稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记及其方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物技术领域，具体涉及水稻稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分 子标记及其方法与应用。
【背景技术】
[0002] 稻瘟病是危害最严重、分布最广泛的稻作病害之一，严重影响了水稻的产量和质 量。全球每年因稻瘟病危害造成的水稻产量损失达到水稻总产量的10%~30%。在我国， 稻瘟病年发病面积达300~600万hm 2,严重年份可达800万hm2,损失稻谷数亿公斤，严重 威胁着我国的粮食安全。培育和推广种植抗病品种是控制稻瘟病最安全、经济而有效的措 施。
[0003] 水稻对稻瘟病的抗性分为质量抗性和数量抗性。质量抗性一般由单个或少数几个 主效基因控制，能够抑制稻瘟病菌的侵入和繁殖，因而呈现高水平的完全抗性。其缺点是对 稻瘟病小种菌具有很强的专化性，致使具有这类抗性的水稻品种往往大面积推广3~5后 就丧失抗性，给水稻生产造成新的损失。数量抗性基因，又称田间抗性或部分抗性，通常受 多个微效基因或数量抗性位点（QTL)控制。这类抗性不能完全抑制稻瘟病菌的侵入，但可 以限制稻瘟病菌的繁殖及病斑的扩展，进而减轻水稻发病的程度。数量抗性对稻瘟病菌小 种无专化性或专化性很弱，具有广谱和持久抗病的特点是具有这类抗性的水稻在生产上往 往具有持久抗病的优点。因此，数量抗性基因的发掘和利用对于培育广谱持久抗稻瘟病品 种尤为重要。
[0004] 传统的水稻抗病育种依赖于抗性表型的鉴定，这不仅要求育种者具有丰富的经验 和敏锐的洞察力，而且鉴定结果极易受环境条件和人为因素的影响，从而降低了目标基因 的选择效率。另外，由于受可鉴别不同基因的鉴别菌系的限制，单纯地依赖表型鉴定很难实 现多个抗性基因的聚合。随着分子标记辅助选择技术的产生和发展，它便捷、直接、不受环 境影响的优点使其应用价值及前景越来越受到关注。开发并应用与抗性基因紧密连锁的分 子标记，特别是基于基因自身序列的功能性分子标记进行辅助选择，不仅可以大大提高抗 源筛选、抗性基因鉴定及育种选择效率，而且使得通过基因聚合手段培育持久、广谱抗病 良种成为可能。
[0005] 迄今，国内外利用分子标记技术已鉴定和定位了 70多个水稻稻瘟病抗性基因，克 隆了 Pia、Pib、Pita、Pil、Pi9、Pi2、Piz-t、Pi-d2、Pi-d3、Pi36、Pi37、Pik、Pik-m、Pik-p、 Pik-h、Pi5、Pi54、Pit、Pish、Pi64 等 20 个主效抗性基因，以及 pi21、Pbl、Pi63 和 Pi35 等 4 个数量抗性基因；并开发了针对 Pita、Pib、Pik、Pikm、Pikp、Pil、Pit、Pi5、Pi25 和 Pi64 等10个主效抗性基因的功能性标记。但是，迄今尚无关于数量抗性基因功能性标记开发的 报道。
[0006] 在已克隆的4个数量抗性基因中，Pbl基因编码一个非典型的NBS-LRR蛋白，它 源自籼稻品种Modan，对穗瘟具有较强的抗性，对叶瘟也有部分抗性，在田间表现较好的 持久抗病性，从而使得含有该基因的品种在日本不同地区种植了 30年仍然未丧失抗性 (Hayashi等2010 ;Fuji等2005)。pi21基因是一个隐性的部分抗性基因，编码一个含有 重金属结合结构域和假定的蛋白-蛋白互作结构域的富含脯氨酸的蛋白，它源自粳稻品 种Owarihatamochi (Fukuoka等，2009)。pi21基因具有非小种专化性，它对防卫反应的一 些特殊机制可能赋予其持久抗病性，从而使得含有该基因的品种可以在日本种植几十年而 不丧失抗性。Pi63基因编码一个典型的NBS-LRR蛋白，它源自日本水稻品种Kahei，该品 种含有多个QTL抗性位点，对稻瘟病表现出较强的田间抗性，Pi63基因是其中贡献率最大 的QTL，基因克隆表明Pi63的抗性水平与基因本身的表达水平有关，表现出剂量效应依赖 的抗性模式（Xu等2014)。Pi35基因也编码一个NBS-LRR家族蛋白，它源自日本粳稻品 种Hokkail88 (Nguyen等，2006)。Pi35是最近被鉴定和克隆的一个新的稻瘟病部分抗性 基因，该基因是Pish的等位变异基因，其多个功能性碱基多态性（multiple functional polymorphisms)的共同作用对稻癌病菌提供了高水平的持久抗性（Fukuoka等，2014)。携 带Pi35基因的2个粳稻品种北海188(Hokkai 188)和藤系138(Fukei 138)在日本自育 成至今近半个世纪以来一直表现稳定且高水平的叶瘟抗性，是日本水稻育种的骨干抗源 (Mikami等，1990 ;Nguyen等，2006 ;Fukuoka等，2014)。Pi35基因的克隆为在育种上有效利 用该基因奠定了基础，但迄今尚未见其功能性标记开发的报道。为了加快Pi35基因在育种 中的应用进程，提高后代的选择效率，降低育种成本，开发出可以准确有效的鉴定数量抗性 基因的功能性分子标记，对通过分子育种手段快速、高效培育持久、广谱抗稻瘟病品种具有 特别重要的意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的首要目的是提供一种鉴定稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记 Pi35-dCAPS。
[0008] 本发明的另一个目的是提供利用上述稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记 Pi35-dCAPS鉴别或筛选含有稻瘟病抗性基因Pi35的水稻品种的方法。
[0009] 本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记 Pi35-dCAPS 的应用。
[0010] 为实现上述发明目的，本发明提供的技术方案是：一种稻瘟病抗性基因Pi35的功 能性分子标记，利用所述分子标记扩增的PCR产物序列如SEQ ID N0.9所示，并且通过特异 限制性内切酶Tail酶切后成为2个片段，大小分别为244bp和28bp。
[0011] 所述分子标记与从特定水稻品种中扩增出来的稻瘟病抗性基因Pi35呈现一致带 型。本发明通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pi35的等位基因序列与Pi35(基因登录号 FW369319)序列做比对的方法，分析得到能区分其他等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的 Pi35功能特异性的一处单碱基差异（3780T)，再通过设计引物得到SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2引物序列，对水稻总DNA扩增、酶切以及琼脂糖凝胶电泳检测，得到可以特异鉴定Pi35 基因的功能性分子标记Pi35-dCAPS，具体步骤如下 ：
[0012] (1)通过水稻数据库（http://www. gramene. org/)及常规PCR法扩增并测序获得 多个水稻品种的Pi35等位基因的编码区DNA序列；
[0013] 所用引物对的核苷酸序列如下所示：
[0014] SEQ ID NO. 3 ：CCTTCATCCCTCAACGTTTTTGTCTCCAAG
[0015] SEQ ID NO. 4 ：ATCGGTATGGAACACTCCAATCCAACTTGT
[0016] (2)利用多序列比对软件工具Clustal W，将步骤⑴所获得的序列翻译成蛋白序 列后进行比对，得到Pi35抗性基因所特异的1个多态性位点，即Pi35编码区的3780T位点， 对应氨基酸位点为1260Cys ;
[0017] (3)根据步骤⑵得到的1个多态性位点分别设计出引物对SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 ;并用这1对引物分别对不同水稻品种的总DNA进行PCR扩增反应，得到PCR扩增 产物，然后对扩增产物进行酶切、电泳检测，得到与稻瘟病抗性基因Pi35呈特异性带型的 核苷酸片段；
[0018] (4)对步骤（3)所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证，确定Pi35的功能 性分子标记Pi35-dCAPS。
[0019] 上述的方法，步骤（1)中所述的水稻品种为藤系138、日本晴和丽江新团黑谷 (LTH);所述的PCR扩增，其中扩增PCR反应体系如下：2XPCR Buffer for KOD FX 25iil， (1阶？8(211116&。11)10111，引物（1(^111〇1，5￡0 10勵.3+5￡0 10勵.4)2111，1(00卩父酶（川/ 111，1'(^080)1111，0嫩模板（100叩/111)2111，加(1(111 20至50111，扩增反应条件：941：2111111; 98°C 10s -59°C 15s -68°C7min，35 个循环；68°C5min，10°C保存；PCR产物大小为 6941bp。
[0020] 步骤（3)中所述的常规PCR扩增，其中扩增PCR反应体系如下：2XPCR Buffer for K0DFX10iil，dNTPs(2mMeach)4iiU|*(10pmol，SEQIDN0.1+SEQIDN0.2)liil，K0D FX 酶（1U/iil，T0Y0B0) 0? 4 iil，DNA 模板（100ng/ill) 2 iil，加 ddH20 至 20 ill ;扩增反应条 件：94°C 2min ;98°C 10s - 59°C 15s - 68°C 30s，35 个循环；68°C 5min，1(TC保存；
[0021] 步骤（3)中所述的扩增产物的大小为272bp，经Tail酶切，酶切体系和条件为PCR 产物 15ii l，10XBuffer 1，Tail 酶 lii 1，ddH2022 ii 1，于 65°C酶切 3h 后；酶切后成为 2 个片段，大小分别为28bp和244bp，取适量酶切产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，得 到与稻瘟病抗性基因Pi35呈特异性带型的核苷酸片段，则待测水稻植株或品种含有稻瘟 病抗性基因Pi35。
[0022] 本发明提供一种鉴别或筛选含有稻瘟病抗性基因Pi35的水稻品种的方法，该方 法是：以待测水稻植株或品种的总DNA为模板，采用如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示序 列的引物对进行PCR扩增，如果得到的扩增产物大小为272bp，并经特异限制性内切酶Tai I 酶切后成为2个片段，大小分别为244bp和28bp，则待测水稻植株或品种含有稻瘟病抗性基 因Pi35 ;否则待测水稻植株或品种不含有稻瘟病抗性基因Pi35。
[0023] 所述的方法，其特征在于：采用如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示序列的引物对 进行PCR扩增，其扩增的PCR反应体系如下：2XPCR Buffer for K0D FX 10iil，dNTPs(2mM 6&吐）4111，引物（1(^111〇1，卩+101111，1(00卩父酶（川/111，1'0￥080)0.4111，0嫩模板（1001^/ ii l)2ii 1，加 ddH20 至 20ii 1，扩增反应条件：94°C 2min ;98°C 10s - 59°C 15s - 68°C 30s， 35 个循环；68°C 5min，10°C保存。
[0024] 所述的方法，采用特异的限制性内切酶Tail酶切所述的PCR扩增产物，其酶切体 系和条件如下：PCR 产物 15ii 1，lOXBuffer l，TaiI 酶 1 ii l，ddH022 ii 1，65°C 酶切 3h 后 经2%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0025] 本发明还提供一种鉴别或筛选含有稻瘟病抗性基因Pi35的水稻品种的引物对， 所述引物对由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示序列的两条引物组成，具体序列如下。
[0026] SEQ ID NO. 1 :GCCGTCCTCCCTCCAGCATATATGTATACG (倒数第二个碱基 C 为人为引入 的突变碱基位点）
[0027] SEQ ID NO. 2 ：GGTGTCTGCAAAACAAAGGAAACGTGAAG
[0028] 本发明还提供一种含有所述的引物对的鉴别或筛选含有稻瘟病抗性基因Pi35的 水稻品种的试剂盒。
[0029] 本发明还提供一种所述的引物对，所述的试剂盒，或所述的分子标记的应用，将其 用于培育水稻抗稻瘟病品种的分子标记辅助育种、基因聚合育种或转基因育种中，还可用 于在大量的水稻种质资源