中筛选、鉴定所述功能抗性基因Pi35。
[0030] 本发明具有如下明显的有益效果：
[0031] Pi35基因是一个数量抗性基因，具有稳定、持久的田间抗性，在水稻育种中具有广 泛的应用价值。
[0032] 本发明通过比较不同水稻品种Pi35等位基因编码区序列，基于Pi35基因特有的 DNA序列位点开发出一套功能性分子标记Pi35-dCAPS。应用这套标记，以常规的PCR技术 为基础辅助以限制性酶切，不仅能够区分不同水稻品种资源的Pi35基因型，而且能够快捷 有效地从育种群体中筛选到携带Pi35基因的个体。这套分子标记遗传稳定，不受环境因素 的影响，可以100%的鉴定出Pi35基因。
[0033] 应用本发明的功能性分子标记Pi35_dCAPS对目标基因进行常规杂交或回交转 育，以及与其他基因聚合，其育种选择目标明确，可以大大节约时间和成本，提高抗稻瘟病 育种效果。本发明的分子标记由于源自基因内部功能性位点之多态性，不存在不良性状的 遗传重组问题。因此，本发明提供的分子标记，对于加速水稻稻瘟病抗性基因Pi35在水稻 育种中的应用具有重要意义。
【附图说明】
[0034] 图1为藤系138及其衍生品种系谱图。
[0035] 图2为Pi35/Pish位点等位基因氨基酸序列比对，其中，箭头表示Pi35蛋白中第 1260位特异的半胱氨酸。
[0036] 图3为藤系138、日本晴和LTH对2个稻瘟病菌株的反应型（A)和3个等位基因 Pi35、pi35-LTH 和 Pish 的 RT-PCR 分析（B)。
[0037] 图4为DNA序列多态性和标记Pi35_dCAPS引物位置。
[0038] 图5为Pi35_dCAPS标记在3个水稻品种中的检测结果，其中，A为酶切前PCR产 物检测；B为Tail酶切后PCR产物检测；M:DNA ladder Trans2K。
[0039] 图6为Pi35-dCAPS标记对10份藤系138衍生品种的检测，其中，A为酶切前PCR 产物检测；B为Tail酶切后PCR产物检测；M:DNA ladder Trans2K。泳道1-11分别为藤 系138、垦鉴稻3号、垦鉴稻6号、垦稻8号、绥粳3号、龙粳34、垦稻12号、垦稻16号、龙花 00-835、龙粳10号和龙粳13号。
[0040] 图7为Pi35-dCAPS标记在部分水稻种质资源中的检测结果，其中，A为为酶切前 PCR产物检测；B为Tail酶切后PCR产物检测；M:DNA ladder Trans2K。泳道1-17分别为： 藤系138、抚宁紫皮粳子、细麻线、龙化毛葫芦、高阳淀稻大红芒、水原300粒、叶里藏花、中 楼1号、卫国、丹东陆稻、兴国、老光头83、白毛稻、木樨球、老虎种、有芒早粳和黄壳早廿日。
【具体实施方式】
[0041] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法（例如：山崎义人、 高坂淖尔编著.稻瘟病与抗病育种（凌忠专、孙昌其译）.农业出版社，1990;凌忠专著.稻 瘟病研究论文集.中国农业出版社.2005;路铁钢等编著.分子遗传学.高等教育出版社， 2008)。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042] 实施例1 :品种藤系138中Pi35基因的确认
[0043] 日本水稻品种北海188是Pi35基因克隆的供体亲本（Fukuoka等，2014. Multiple functional polymorphisms in a single disease resistance gene in rice enhance durable resistance to blast. Scientific Reports, 4:4550D01:10. 1038/srep04550), 其衍生品种藤系138(图1)保持了北海188的高水平部分抗性，且经遗传分析证实藤系 138的部分抗性受单个的主效基因控制（Mikami等，Estimation of resistance genes and field resistance to leaf blast of a rice cultivar "Fukei 138，'，Rep. Tohoku Br.，Crop Sci.Soc. Japan 33:87 - 88)。为确认藤系138携带Pi35基因，我们利用引物对 SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4对藤系138的基因组DNA进行PCR扩增，获得了 Pi35的等位基 因并命名为Pi35-Fukeil38。对Pi35-Fukeil38测序、拼接和序列比对，发现Pi35-Fukeil38 的DNA和氨基酸序列与数据库中公布的Pi35的完全一致（图2)。综合前人及本发明研究 结果，我们确信藤系138携带部分抗性基因Pi35。
[0044] 实施例2 :Pi35/Pish位点基因序列比对分析
[0045] 在日本晴中，Pish基因位点包含4个串联的NBS-LRR基因（0s01g0781100、 0s01g0781200、0s01g0781700和Pish)，而Pi35是Pish的一个等位变异基因。为了设计和 开发特异性鉴定Pi35基因的功能性标记，我们首先从水稻数据库中获得日本晴Pish基因 位点4个基因的编码区DNA序列，经序列比对发现第一个基因0s01g0781100与后面3个基 因相似性较低（氨基酸序列一致性分别为65. 7%、65. 6%和65. 53% .)，而后面3个基因之 间则具有很高的序列相似性（表1)。同时利用引物对SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4对国内 外稻瘟病菌普遍高度感病水稻品种LTH进行基因组DNA扩增，经对扩增产物测序获得了 LTH 中Pi35/Pish的等位基因序列并命名为pi35-LTH(图2)。随后，利用Clustal W软件对5个 基因（Pi35、pi35-LTH、Pish、0s01g0781200 和 0s01g0781700)编码的蛋白质序列进行了多 序列比对分析（图2)，结果发现，Pi35与pi35-LTH仅在LRR区（位置589-1289)存在一个氨 基酸的差异（C1260W);与Pish蛋白在NBS结构域（位置169-588)存在一个氨基酸的替换 (S503P)和一个氨基酸的缺失（510G)，在LRR结构域存在5个氨基酸的差异（1053D/1054E， 1055S/1056R，1072P/1073Q，1082W/1083N 和 1260C/1261W);与 0s01g0781200 和 0801§0782100相比，则分别存在10.93和2.02%的氨基酸序列差异（图2)。在上述所有 蛋白的变异氨基酸中，第1260位的半胱氨酸为Pi35蛋白所特有，是Pi35与pi35-LTH蛋白 之间差异氨基酸（图2)。鉴于Pi35基因对日本稻瘟病菌株Ken54-20和Ken53-33表现高 水平的部分抗性，而LTH对这2个菌株表现高度感病（图3A)，我们推测该氨基酸的差异可 能决定着Pi35与pi35-LTH对鉴别菌株的抗、感病差异。进一步，我们分析了 pi35-LTH基 因的启动子区和下游区序列，发现Pi35-LTH基因的启动子区2041bp和下游1885bp序列 与Pi35基因对应的序列完全一致；同时利用引物对SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6对藤系 138中的Pi35、LTH中的pi35-LTH及日本晴的Pish基因进行了 RT-PCR分析，PCR反应体 系如下：2XPCR Buffer for KOD FX lOiil，dNTPs(2mM each)4iil，引物（10pmol，SEQ ID NO. 5+SEQ ID NO. 6) 1 ii 1，KOD FX 酶（1U/ii 1，T0Y0B0) 0? 4 ii 1，cDNA 模板（lOOng/ii 1) 2 ii 1， 加 ddH20 至 20ii 1，扩增反应条件：94°C 2min ;98°C 10s - 59°C 15s - 68°C lmin，33 个循 环；68°C5min，10°C保存；以水稻OsActin基因作为对照，所用引物对为SEQ ID NO. 7和SEQ ID N0.8 ;结果表明Pi35、Pish及pi35-LTH等3个基因在各自的背景品种中均能正常表达 (图3B)。综合以上分析，我们推断藤系138和LTH对鉴别菌株的抗与感差异应该与基因的 表达无关，而与基因序列本身的差异（G3780T)有关；第1260位的半胱氨酸是Pi35蛋白的 功能氨基酸，该单个氨基酸的差异区分了 Pi35的抗病和感病等位基因。
[0046] 表1 Pi35/Pish基因位点氨基酸序列一致性分析
[0047]
【主权项】
1. 一种鉴别或筛选含有稻瘟病抗性基因^碰]水稻品种的方法，其特征在于： 以待测水稻植株或品种的总DNA为模板，采用如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示 序列的引物对进行PCR扩增，如果得到的扩增产物大小为272 bp，并经特异限制性内切酶 Ail酶切后成为2个片段，大小分别为244 bp和28 bp，则待测水稻植株或品种含有稻瘟 病抗性基因否则待测水稻植株或品种不含有稻瘟病抗性基因
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所 示序列的引物对进行PCR扩增，其扩增的PCR反应体系如下：2 X PCR Buffer for KOD FX 10 iil，每种 2 mM 的 dNTPs 4 iil，10 pmol 上下游引物 1 iil，l U/iil KOD FX 酶 0.4 yl，100 ng/iil DNA 模板 2 iil，加 ddH20 至 20 iil，扩增反应条件：94°C 2 min;98°C 10 s - 59°C 15 s - 68°C30 s，35 个循环；68°C 5 min，10°C保存。
3. 根据权利要求1或2所述方法，其特征在于：采用特异的限制性内切酶Ail酶切所 述的PCR扩增产物，其酶切体系和条件如下：PCR产物15 iil，10 X Buffer 2 iil，hi/ 酶1 iil，ddH02 2 iil，65°C酶切3 h后经2%琼脂糖凝胶电泳检测。
4. 一种鉴别或筛选含有稻瘟病抗性基因碰]水稻品种的引物对，其特征在于：所述 引物对由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示序列的两条引物组成。
5. -种含有权利要求4所述的引物对的鉴别或筛选含有稻瘟病抗性基因碰]水稻 品种的试剂盒。
6. -种稻瘟病抗性基因碰]功能性分子标记，其特征在于：利用所述分子标记扩增 的PCR产物序列如SEQ ID NO. 9所示，并且通过特异限制性内切酶Ail酶切后成为2个 片段，大小分别为244 bp和28 bp。
7. -种如权利要求4所述的引物对，如权利要求5所述的试剂盒，或如权利要求6所述 的分子标记的应用，其特征在于：将其用于培育水稻抗稻瘟病品种的分子标记辅助育种、基 因聚合育种或转基因育种中。
【专利摘要】本发明公开了水稻稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记Pi35-dCAPS及其方法与应用。通过比对和分析多个水稻品种中Pi35等位基因序列，得到有别于Pi35感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pi35功能特异性位点1处（3780T）；通过设计引物，分别得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；利用该引物扩增水稻总DNA,并对扩增产物进行特异性酶切及电泳检测后获得Pi35的功能性分子标记Pi35-dCAPS。本发明可在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定稻瘟病抗性基因Pi35，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中应用。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104673917
【申请号】CN201510082155
【发明人】万建民, 马建, 雷财林, 马小定, 赵志超, 王洁, 王久林, 程治军, 张欣, 郭秀平
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月15日