一种稻瘟病菌无毒基因AvrPi9、编码的多肽、多核苷酸及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了稻瘟病菌无毒基因AvrPi9、编码的多肽、多核苷酸及其应用。本发明提供了一个稻瘟病菌(Magna-porthe?grisea)新无毒基因Avr-Pi9的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列，该基因是一个在侵染植物时特异诱导表达的基因。基于该基因，可制备抗病能力增强的转基因植物，或制备出跟踪稻瘟病菌种群变化的分子标记物。
【专利说明】—种稻瘍病菌无毒基因AvrP i 9、编码的多肽、多核苷酸及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，具体涉及一种水稻稻瘟病菌无毒基因Avr-Pi9的分离克隆与应用。
【背景技术】
[0002]水稻(Oryza sativa L.)是我国第一大粮食作物，也是全世界最重要的粮食作物。稻痕菌(Magnaporthe oryzae)是引起水稻稻痕病的病原物,全世界每年因为稻痕病造成10%~30%的水稻产量损失，严重田块甚至颗粒无收。目前防控稻瘟病的手段主要是施用农药和种植抗性品种。施用农药存在污染环境增加生产成本，影响稻米品质等一系列不利因素，因此抗病品种的选育和推广是目前防控稻瘟病最为经济和有效的手段。然而，自然环境中，在水稻抗性品种的选择压下，稻瘟菌菌群替换迅速能突破抗性品种方向的新的生理小种并形成优势种群，最终导致抗性品种抗性“丧失”。在生产实践中抗性品种连续种植3-5年后，抗性就会明显衰退，抗病无法持久化。如何监控稻瘟病菌生理小种发生动态，培育持久抗病的品种以及寻找更为有效的抗病育种策略，成为目前生产上的迫切要求。
[0003]水稻与稻瘟病菌之间的互作机制符合“基因对基因”假说(Flor，1947 ；Silue etal., 2000 ；Bryan et al., 2000 ；Orbach et al.2000)。根据这一理论，水稻通过其抗性基因(R基因)特异识别来源于稻瘟病菌的无毒基因(Avr基因)，从而激发水稻体内一系列的抗病防卫反应。在过去的二十年中，国内外有关水稻抗稻瘟病基因方面的研究取得了很大的进展，至少已经报道了 63个抗稻瘟病位点共77个主效基因(国家水稻数据中心.稻瘟病主效抗性基因列表[D B/OL].http://www.ricedata.cn/gene.)。这些基因大大加快了水稻抗病育种进程。然而，R基因介导的抗性具有严格的种属专一性，不同的R基因与其识别因子具有严格的对应关系，病原菌小种致病力的高变异性易导致R基因介导的抗性消失。要解决这一问题，需要深入研究抗性基因与无毒基因之间互作关系的实质，继而提供新的广谱抗病基因工程策略与方法(Wit.1992 ；Bryan et al.，2000 ；Orbach et al.2000)。目前，相对于水稻抗稻瘟病基因的研究，稻瘟菌无毒基因克隆方面相对滞后，尽管大约有40个无毒基因已经被报道，但是只有9个无毒基因被克隆，其中PWLl (Kang et al.，1995)和PWL2 (Sweigard et al., 1995)是弯叶画眉草寄主特异性的，剩下的AvrP1-ta(Orbachet al., 2000)、ACEl (Bohnert et al., 2004)、Avr1-C039(Farman and Leong, 1998)、AvrPiz-t (Li et al., 2009)、AvrPii> AvrPia 和 AvrPik/km/kp (Yoshida et al., 2009)这 7个是控制稻瘟菌对水稻致病性的。其中只有ACEl编码了一个非分泌的聚酮合成酶基因，其他8个无毒基因均编码了预测的分泌蛋白。在这些已经克隆的抗性基因和无毒基因之间只有 Pi_ta 与 Avr-Pita, Pia 与 Avrpia, Piz-t 与 AvrPiz-t 和 Pikm 与 AvrPik km | kp 是成对的，并且只有P1-ta与AvrP1-ta之间有直接相互作用的分子证据。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供稻瘟病菌无毒基因的克隆方法及分子标记。
[0005]在本发明的第一方面，提供一种稻瘟病菌无毒基因AvrPi9编码的多肽，该多肽选自下组:
[0006](a)具有SEQ ID NO: 3氨基酸序列的多肽；
[0007](b)将SEQ ID NO: 3氨基酸序列经过一个或多个(如1_50个，较佳地1_30个，更佳地1-10个，更佳地1-5个，更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有能与水稻抗稻瘟病基因Pi9编码的蛋白质互作功能的由(a)衍生的多肽。
[0008]在本发明的另一方面，提供稻瘟病菌无毒基因AvrPi9，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组:
[0009]编码所述多肽的多核苷酸；与上述多核苷酸互补的多核苷酸。
[0010]在另一优选例中，所述的多核苷酸是:
[0011]具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸；具有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0012]在本发明的另一 方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
[0013]在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体；或其基因组中整合有所述的多核苷酸。
[0014]在本发明的另一方面，利用所述氨基酸序列或核苷酸序列或载体或遗传工程化的宿主细胞，用于培育抗病植物品种。
[0015]在本发明的另一方面，利用所述氨基酸序列或核苷酸序列，用于鉴定稻瘟病菌的侵染能力，或用于制备检测植物稻瘟病菌毒性群体分布的标记物。这些标记物包括但不限于SNP (单核苷酸多态)、SSR (简单序列重复多肽),RFLP (限制性内切酶长度多肽)、CAP (切割扩增片段多肽)。
[0016]在本发明的另一方面，提供所述的分子标记物的用途，用于水稻品种的种植布局。
[0017]本发明的有益效果是:
[0018]本发明获得一种新的稻瘟病菌无毒基因AvrPi9，基于所述基因的结构和功能研究结果，可广泛用于新型农药开发、稻瘟病菌生理小种监测以及水稻稻瘟病分子互作理论研究；基于所述基因的序列，可建立监控稻瘟病菌自然群体致病性变异的分子标记检测系统；了解所述基因在田间自然群体中的变化动态，从而指导水稻品种种植布局和轮换，以有效控制病害的发生；利用所述基因与相应的抗病基因以及合适的启动子进行组装，构建广谱持久抗病的基因工程载体，并进而导入水稻或其他植物细胞，培育广谱持久抗病的水稻品种。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明通过192个R01-1特异性的分子标记鉴定26个混合菌株中R01-1的突变供体菌株，并根据PCR扩增条带的比较和结果统计,采用邻接法(Neighbor-joining)构建的系统进化树；
[0020]图2为AvrPi9候选基因的自然菌株扫描结果和基因结构，无毒菌株R88-002和Guyll中1434和1435号基因都存在且一致；有毒菌株R01-1中两个基因都存在但是1434号基因内部有转座子Mg-SINE插入；[0021]图3为本发明对AvrPi9候选基因的互补功能鉴定，将候选基因1434和1435分别导入到有毒菌株R01-1和75-5中，各个转化事件获得的转化菌株利用Tp309和导入抗病基因Pi9的Tp309单基因系(Pi9-Tp309)进行致病性鉴定。图3A为R01-1转化子接种验证结果，图3B为75-5转化子接种验证结果。结果表明，R1434就是AvrPi9基因。
[0022]图4为本发明对AvrPi9基因功能丧失转化子的PCR检测结果及功能鉴定结果图。图4A为对AvrPi9基因功能丧失转化子的PCR检测结果，分别为敲除R1434的转化子RJ1-43、敲除R1434和RJ1435的转化子RJ2-7和RJ2-15、敲除RJ1435的转化子RJ3-53。图4B对丧失转化子功能鉴定结果，实验结果进一步确认了 R88-002中的R1434就是AvrPi9基因。
【具体实施方式】
[0023]下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0024]实施例1:携带无毒基因AvrPi9野生型稻瘟菌菌株R88-002的确定。
[0025]R01-1是通过26个AvrPi9菌株混合物连续接种的方法筛选到的一个avrPi9突变体(Kim BR, et al.，2004)。因此，可以非常合理地推测R01-1应该来源于26个混合菌株中的一个。本发明通过开发192个R01-1特异性的分子标记(表1)来鉴定26个混合菌株中R01-1的突变供体菌株，结果如表2所示，与R01-1相比，菌株R88-002没有观察到多态，而菌株85-242则多态性最丰富。根据PCR扩增条带的比较和结果统计，采用邻接法(Neighbor-joining)构建系统进化树(附图1)，最终确定R88-002为R01-1菌株的野生型。 [0026]表1用于鉴定R01-1和26个菌株亲缘关系的PCR引物
【权利要求】
1.一种稻瘟病菌无毒基因AvrPi9，其特征在于，它是:具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸；具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的多核苷酸。
2.—种权利要求1所述稻瘟病菌无毒基因AvrPi9编码的多肽，其特征在于:所述多肽选自下组: (a)具有SEQID NO:3氨基酸序列的多肽； (b)将SEQID NO: 3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有能与水稻抗稻瘟病基因Pi9编码的蛋白质互作功能的由(a)衍生的多肽。
3.一种与权利要求1所述稻瘟病菌无毒基因AvrPi9等同的多核苷酸，其特征在于:编码权利要求2所述多肽 的多核苷酸；与上述多核苷酸互补的多核苷酸。
4.一种权利要求1所述稻瘟病菌无毒基因AvrPi9的应用，其特征在于应用于构建含有权利要求1或3所述的多核苷酸序列的载体。
5.根据权利要求1-3任何一项在培育抗病植物品种中的应用。
6.根据权利要求4所述的载体在培育抗病植物品种中的应用。
7.利用权利要求1-3任何一项在检测植物稻瘟病菌毒性群体分布及水稻品种种植布局中的应用。
【文档编号】C12N15/29GK104004771SQ201410258019
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月11日 优先权日:2014年6月11日
【发明者】周波, 吴俊 , 鲍坚东, 朱小丽, 唐明智, 王 华 申请人:浙江省农业科学院