抗生素Versicoloids A和B及其制备方法和在制备抗植物病原菌药物中的应用
【技术领域】：
[0001 ]本发明属于海洋天然产物领域，具体涉及新的抗生素Versicoloids A和B及其制 备方法和在制备抗植物病原菌中的应用。
【背景技术】：
[0002] 目前，农业生产上存在的植物病原菌主要有胶孢炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、香蕉枯 萎病菌、黄瓜疫霉枯萎病菌、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、甘蔗凤梨病菌等，其分布广泛， 对农作物的生产危害极大。随着人民生活水平的不断提高，对食用农副产品的品质要求也 越来越高。因此，从天然产物中筛选和寻找防治植物病原菌的活性先导化合物，对人类健 康、农业与环境的可持续发展都具有极其重要的意义。
【发明内容】
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[0003] 本发明的第一个目的是提供一类新的具有抗植物病原菌活性的生物碱化合物 Versicoloids A和B〇
[0004] 本发明的一类新的生物碱化合物Versicoloids A或B，其结构如式(I)所示：
[0006] 本发明的第二个目的是提供生物碱化合物Versicoloids A和B的制备方法。
[0007] 本发明的Versicoloids A和B是从曲霉(Aspergillus sp.)SCSI0 05879的发酵培 养物中制备分离得到的。
[0008] 本发明优选通过以下方法从曲霉(Aspergillus sp.)SCSI0 05879的发酵培养物 中制备得到Versicoloids A和B，具体步骤如下：
[0009] 制备曲霉(Aspergillus sp.)SCSI0 05879的发酵培养物，分离得到上清发酵液和 沉淀菌丝体，上清发酵液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩得发酵液浸膏;沉淀 菌丝体用丙酮水溶液超声浸提，提取液经减压蒸馏后，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液 经减压浓缩得菌丝体浸膏;合并发酵液浸膏和菌丝体浸膏得粗浸膏，经硅胶柱层析分离，采 用二氯甲烷/甲醇从 100:0,99:l，98:2,97:3,95:5,90:10,80:20,50:50,0:100，v/v梯度洗 脱，收集二氯甲烷/甲醇l〇〇:〇v/V冼脱的组分frl，经Sephadex LH-20柱层析，以二氯甲烷/ 甲醇1:1，v/v为洗脱剂，洗脱后的产物经纯化得到Versicoloid A和Versicoloid B。
[0010] 所述的洗脱后的产物经纯化得到Versicoloid A和Versicoloid B具体是以250和 340nm波长做检测、采用4mL/min的流速，以甲醇:水(65:35，v/v)进行等梯度洗脱进行半制 备高效液相分离，HPLC(Sunf ire，Prep Ci8〇I3D，10 X 250mm，5ym)，得到Versicoloid A (4.6mg，保留时间tR 22.6min)和Versicoloid B(6.1mg,保留时间tR 16. lmin)。
[0011] 所述的制备曲霉(Aspergillus sp. )SCSI0 05879的发酵培养物优选是通过以下 方法制备：将活化的曲霉(Aspergillus sp.)SCSI0 05879接入种子培养基，28°C，180rpm， 培养48h得种子液，将种子液以体积比5%的接种量接入到发酵培养基中，28°C，180rpm，静 置培养40天，而制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基 中含有可溶性淀粉l〇g，鱼蛋白胨lg，粗海盐20g，余量为水，pH 7.5。
[0012]本发明的第三个目的是提供曲霉(Aspergillus sp.)SCSI0 05879在制备化合物 Versicoloids A或B中的应用。
[0013]本发明人通过实验发现，化合物Versicoloids A和B对胶孢炭疽病菌、水稻稻瘟病 菌和香蕉枯萎病菌有明显的生长抑制活性，其|〇(：值分别是1.6/1.6邱1111/1、128/128邱1^ <和64/64yg ml/1。因此，本发明的第四个目的是提供化合物Versicoloids A或B在制备抗 菌药物中的应用。
[0014] 所述的抗菌药物优选为抗胶孢炭疽病菌、水稻稻瘟病菌或香蕉枯萎病菌的药物。
[0015] 本发明的第五个目的是提供一种抗菌药物，其特征在于，包含有效量的 Versicoloids A或B作为活性成份。
[0016] 所述的抗菌药物优选为抗胶孢炭疽病菌、水稻稻瘟病菌或香蕉枯萎病菌的药物。 [0017]本发明从曲霉(Aspergillus sp.)SCSI0 05879分离得到2个新的具有抗菌活性的 生物碱化合物Versicoloids A和B，其能用于制备抗菌药物，通过生物工程或化学修饰可望 开发成为抗菌新药。
[0018] 本发明的曲霉(Aspergillus sp.)SCSI0 05879是从印度洋水深为-3927米的沉积 物(6° (K/ 00〃N，87° 3(/ 50〃E)中分离获得的。
[0019] 本发明的曲霉(Aspergillus sp.)SCSI0 05879,其于2015年7月17日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所，保藏号为:CGMCC No. 11123。
【附图说明】：
[0020] 图 1 化合物Versicoloid A的关键的1H-1!! COSY,HMBC和N0E相关。
[0021] 图2化合物Versicoloids A(l)和B(2)的实测CD及计算ECD图谱。
【具体实施方式】：
[0022]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0023] 实施例1:活性代谢产物Versicoloids A和B的分离和制备
[0024] 1、种子培养基和发酵培养基：可溶性淀粉10g，鱼蛋白胨lg，粗海盐20g，水1L， PH7.5，混合均匀后调pH值，灭菌备用。
[0025] 2、发酵
[0026] 2.1、种子培养:将培养皿上活化的曲霉(Aspergillus sp.)SCSI0 05879的单菌落 分别接入30瓶，每瓶含有50mL种子培养基的250mL的锥形培养瓶中，28°C，180r ? mirT1，培养 48h，制得种子液1500mL。
[0027] 2.2、发酵培养:将种子液以5 %的接种量(体积百分比）接入到30L发酵培养基(置 于1000mL的锥形培养瓶，每瓶含有300mL发酵培养基，共100瓶）中，28°C，180r ? min-1，静置 培养40天，得到30L发酵培养物。
[0028] 3、萃取:发酵培养物先进行离心分离(3500r ? min-Ssmin)，得到30L体积的上清发 酵液和沉淀菌丝体。上清发酵液用乙酸乙酯等体积萃取3次，乙酸乙酯萃取液在低于40°C减 压浓缩得发酵液浸膏;沉淀菌丝体用体积分数85 %的丙酮水溶液超声浸提，提取液经减压 蒸馏后，再用乙酸乙酯反复萃取三次，乙酸乙酯萃取液在低于40°C下减压浓缩得菌丝体浸 膏;合并发酵液浸膏和菌丝体浸膏共计得约18.3g粗浸膏。
[0029] 4、活性化合物的提取分离和鉴定
[0030] 4.1化合物Versicoloids A和B的提取分离和鉴定:粗浸膏用300-400目硅胶柱层 析分离，经拌样、干法装柱后，采用二氯甲烷/甲醇从100: 〇，99:1，98: 2，97: 3，95:5，90:10， 80: 20，50:50，0:100，v/v梯度洗脱顺序得6个组分(fr 1-fr6)。组分fr 1 (二氯甲烷/甲醇100: 〇v/V冼脱的组份)经Sephadex LH-20柱层析，以二氯甲烷/甲醇（l:l，V/v)为洗脱剂，洗脱纯 化后的产物，以250和340nm波长做检测、采用4mL/min的流速，以甲醇:水(65:35，v/v)进行 等梯度洗脱进行半制备高效液相分离，冊1工(3111^;^，？^口（：18〇130，10/25〇111111，5111]1)，得到 Versicoloid A(4.6mg，保留时间tR 22.6min)和Versicoloid B(6.1mg,保留时间tR 16. lmin)。通过结构分析，对本发明的从曲霉(Aspergillus sp.)SCSI0 05879的发酵培养 物中制备得到的两个化合物一化合物1 (对应化合物Versicoloid A)和化合物2(对应化合 物Versicoloid B)(式(I))对其进行鉴定，其鉴定结果如下：
[0031]化合物 1 (Versicoloid A):黄色油状物，NMR(500MHz，DMS0-d6)和 13C NMR (125MHz，DMS〇-d6)数据，见表 1;HRESIMS m/z 382.1726[M+Na] + (calcd for Ci9H25N3Na〇4， 382.1737)。
[0032] 化合物1的高分辨电喷雾质谱图显示其准分子离子峰为m/z[M+Na]+382.1726,推 测其分子式为C19H25N3〇4(不饱和度为9)。分析1H， 13C和HSQC(表1)数据表明该化合物含有5个 甲基[知 3?64(H3-20)，l?07(d，J = 6?9，H3-19)，0?96(d，J = 6?4，H3-23)，0?91(d，J = 6?4，H3-22)， 和0.81(^=6.9，出-22)]，1个叩3杂化的亚甲基，3个叩2杂化的次甲基，4个叩 3杂化的 次甲基，6个sp2杂化的季碳。通过HMQC谱图、七-咕⑶SY图谱、HMBC谱图（图1)分析显示化合 物 1 与已知化合物Oxepinamides B[Chem.Eur.J.2000,6(8): 1355-1360]很相似，推测是化 合物1中的结I氨酸残基代替了已知化合物Oxepinamides B中的丙氨酸残基部分。在HMBC谱 图中，出现了关键的H-15与C-l，C-4和C-13以及H-3与C-16，C-17和C-19的相关信号，证明了 缬氨酸残基的存在。进一步的Noesy谱图显示，可以观察到H-3和H-21的相关信号，推测了 H-3和H-15在哌嗪六元环的异侧。同时通过计算化合物1的ECD谱图（图2)，结合其生物合成途 径将其绝对构型推测为3R和15S。
[0033] Versicoloid A的结构如下所不：
[0035]化合物2(Versicoloid B):黄色油状物，NMR(500MHz，DMS0-d6)和 13C NMR (125MHz，DMS〇-d6)数据，见表 1;HRESIMS m/z 398.1689[M+Na] + (calcd for Ci9H25N3Na〇5， 398.1686)〇
[0036] 化合物2的高分辨电喷雾质谱图显示其准分子离子峰为m/z[M+Na]+398.1689,推 测其分子式为C19H25N3〇5(不饱和度为9)。分析 1H，13C和HMQC(表1)数据表明化合物2与化合物 1结构上非常相似，分子量上只相差一个氧原子。进一步分析一维的咕和 13C谱发现，化合物2 比化合物1少一个sp3杂化的次甲基，多一个sp3杂化的季碳，且为连氧季碳，结合分子式推测 是3位上的羟基取代了化合物1中3位的氢原子。关键的HMBC相关信号H 2-17和H3-19与C-3的 相关证明了以上推测的正确性。化合物2的旋光数据0R(c 0.3，MeOH)-114.9°和圆二色谱数 据CD(c 0.02，Me0H)(八￡)218(+20.6)，245(-14.9)确定化合物2的立体构型与化合物1旋光 数据 〇R(c 0.4，Me0H)-239.4° 和 CD(c 0.02，Me0H)( A e)219(+13.6)，2248(-16.4)-致，其 绝对构型同样推测为3R和15S。
[0037] Versicoloid B的结构如下所不：
[0039] 表1.化合物Versicoloids A和B的核磁数据归属(CD30D，500MHz)
[0043] 实施例2:Versicoloids A和B的抑菌活性的测定
[0044] Versicoloids A和B针对三种植物病原菌:胶孢炭疽病菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯 萎病菌进行了活性测定，实验方法参考文献[Dang Q L.，Shin T S.，Park M S.，Choi Y H.,ChoiG J.,Jang K S.,Kim I S.,Kim J C.,Antimicrobial activities of novel mannosy1 lipids is dated from the biocontrol fungus Simplicillium lamellicola BCP against phytopathogenic bac teria.J.Agric.Food Chem.,2014,62, 3363-3370]。以放线菌酮作阳性对照(对胶孢炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌的MIC 值分别是6.4yg mL-/l2.8yg mL-1和12.8yg mL-4。结果表明Versicoloids A对胶孢炭疽病 菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌的MIC值分别是1.6yg mL-mL-1和64yg mL-1; Versicoloids B对胶孢炭疽病菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌的MIC值分别是1.6yg mL 一/l28yg ml/1和64yg mdVersicoloi ds A和B对所测的三种植物病原菌表现有生长抑制 活性，通过生物工程或化学修饰可望开发成为抗植物病原菌新药。
【主权项】
1. 化合物Versicoloids A或B，其结构如式(I)所示：2. -种权利要求1所述的化合物Versicoloids A和B的制备方法，其特征在于，所述的 化合物Versicoloids A和B是从曲霉(Aspergillus sp.)SCSI0 05879的发酵培养物中制备 分离得到的。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下： 制备曲霉(Aspergillus sp. )SCSI0 05879的发酵培养物，分离得到上清发酵液和沉淀 菌丝体，上清发酵液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩得发酵液浸膏;沉淀菌丝 体用丙酮水溶液超声浸提，提取液经减压蒸馏后，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液经减 压浓缩得菌丝体浸膏;合并发酵液浸膏和菌丝体浸膏得粗浸膏，经硅胶柱层析分离，采用二 氯甲烷 / 甲醇从 100:0,99:l，98:2,97:3,95:5,90:10,80:20,50:50,0:100，v/v 梯度洗脱，收 集二氯甲烷/甲醇l〇〇:〇v/V冼脱的组分frl，经Sephadex LH-20柱层析，以二氯甲烷/甲醇1: 1，v/v为洗脱剂，洗脱后的产物经纯化得到Versicoloid A和Versicoloid B。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的制备曲霉(Aspergi 1 lus sp.) SCSIO 05879的发酵培养物是通过以下方法制备:将活化的曲霉(Aspergillus sp.)SCSI0 05879接入种子培养基，28°C，180rpm，培养48h得种子液，将种子液以体积比5%的接种量接 入到发酵培养基中，28°C，180rpm，静置培养40天，而制得发酵培养物，所述的种子培养基和 发酵培养基的配方都为每升培养基中含有可溶性淀粉l〇g，鱼蛋白胨lg，粗海盐20g，余量为 水，pH 7 · 5 〇5. 曲霉(Aspergillus sp. )SCSI0 05879在制备权利要求1所述的化合物Versicoloids A或B中的应用。6. 权利要求1所述的化合物Versicoloids A或B在制备抗菌药物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物为抗胶孢炭疽病菌、水稻 稻瘟病菌或香蕉枯萎病菌的药物。8. -种抗菌药物，其特征在于，包含有效量的Versicoloids A或B作为活性成份。9. 根据权利要求8所述的抗菌药物，其特征在于，所述的抗菌药物为抗胶孢炭疽病菌、 水稻稻瘟病菌或香蕉枯萎病菌的药物。10. 曲霉（Aspergillus sp.)SCSI0 05879,保藏号为：CGMCC No. 11123。
【专利摘要】本发明公开了抗生素Versicoloids A和B及其制备方法和在制备抗植物病原菌药物中的应用。Versicoloids A和B，结构式如式(I)所示，其是由曲霉(Aspergillus sp.)SCSIO 05879发酵产生，对胶孢炭疽病菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌有生长抑制活性，对其进行生物工程改造或化学结构修饰有望开发成为抗植物病原菌新药。CGMCC No. 1112320150717
【IPC分类】C12P17/18, C12N1/14, A01N43/90, A01P3/00, C07D491/147, C12R1/66
【公开号】CN105713002
【申请号】CN201610046509
【发明人】王俊锋, 贺卫军, 黄小龙, 田新朋, 刘永宏
【申请人】中国科学院南海海洋研究所