一种橡胶树白粉病菌rna的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是指一种橡胶树白粉病菌RNA的提取方法。
【背景技术】
[0002] 橡胶树白粉病是由粉孢属的橡胶粉孢（腫AereaeB.A.Steinmann)侵染引起 的病害，该病菌广泛分布于全球各橡胶种植区，也是我国植胶区早春防治"两病一虫"的重 点。橡胶树白粉菌是专性寄生菌，无法在人工培养基离体培养，难遗传操作，更多研宄集中 于细胞学观察和防治，目前尚未培育出生产上大规模推广的抗白粉菌橡胶树品系，关于橡 胶树白粉菌致病基因功能验证的分子实验体系尚未建立，病原菌致病机理缺乏详尽研宄。 万三连等通过改良Trizol提取方法获取的白粉菌RNA能够满足构建转录组文库要求。改 良Trizol提取RNA法，是在Trizol真菌RNA提取法基础上提高提取液的盐浓度，增加溶液 中的盐浓度可以减少RNA溶于提取液中，促进多糖及蛋白等溶于溶液。同时，结合OMEGA真 菌RNA试剂盒法中的制备管吸附RNA，可以减少挥发乙醇的时间，防止RNA降解。
[0003] 改进的Trizol方法收集提取的白粉菌实际上是孢子和菌丝组织混合体RNA，无法 获得白粉菌在萌发及附着胞形成状态均一的孢子，缺少侵染发育过程中白粉菌组织的培养 收集和RNA提取手段，无法开展侵染过程中功能基因的表达研宄。
【发明内容】
[0004] 本本发明提出一种橡胶树白粉病菌RNA的提取方法，所得的RNA浓度及完整性符 合Illumina转录组文库要求。
[0005] 本发明的技术方案是这样实现的： 一种橡胶树白粉病菌的RNA的提取方法，包括以下步骤： (1) 采用接菌培养l〇~12d后24h龄的新鲜分生孢子作为实验菌源；将疏水介质置于 底部有湿润滤纸的保鲜盒中，用软毛刷将橡胶叶片上的白粉菌孢子轻刷于疏水介质表面， 培养温度21~23°C，相对湿度50%~80%，保鲜盒避光密封保存； (2) 保鲜盒中培养0~24h后，加入预冷的Trizol裂解液于介质上，用涂抹棒蘸取裂解 液反复涂刮接菌介质表面，待介质上的裂解液内可见白色粉状物或出现浑浊时，用移液器 收集裂解液转移到预冷的离心管中，震荡混匀，20~25°C静置8~10min; (3) 离心管加入氯仿，振荡混匀，20~25°C静置后离心； (4) 离心后，转移上层水相到新的RNasefree离心管中，加入醋酸钾，颠倒混匀，离心， 20~25°C静置得混合溶液； (5) 加入与混合液等体积的异丙醇，混匀，沉降RNA样品； (6) 经步骤（5)处理后，离心后移去上清液，加入DEPC水溶解沉淀；随后加入RB、70%乙 醇和巯基乙醇，颠倒混匀； (7) 经步骤（6)处理后，离心后加入DEPC水洗脱RNA，即得橡胶树白粉病菌RNA。
[0006] 进一步，所述步骤（1)接种前24h摇动叶片抖落老孢子，以新生24h龄分生孢子 作为接种材料；所述的疏水介质为Parafilm膜。
[0007] 进一步，所述步骤（2)震荡后确保离心管中无真菌团块。
[0008] 进一步，所述步骤（3)加入氯仿体积为离心管内液体体积的1/4~1/3;振荡时间为 15~20s，0~25°C静置时间为5~7min，离心的条件为4°C，10000~12000g，离心15~20min; 2〇
[0009] 进一步，所述步骤（4)加入醋酸钾溶液的体积为水相体积的1/3,pH值为6. 0 ;离 心条件为4°C，8000~10000g，离心1. 0~L5min;静置时间为5~7min。
[0010] 进一步，所述步骤（5)RNA样品沉降时间为2~10h，沉降过程中控制温度-80 °C。
[0011] 进一步，所述步骤（6)离心操作条件为4 °C，12000~14000g，离心10 ~12min;加 入的DEPC水、RB、70%乙醇和0 -巯基乙醇的体积比=100~120 :350~400 :250~300 :7~9。
[0012] 进一步，所述步骤（7)离心操作条件为4 °C，10000~12000g，离心时间30~40s; DEPC水的加入量为步骤（6)所得样品总体积的1/7~1/6。
[0013] 本发明的有益效果： 接种前，通过培养i2d后，新鲜a子形态饱满，活力旺盛，选取同一批次Aereae新鲜分生孢子接种Parafilm膜，保证子在介质上侵染发育状态的一 致性。在parafilm疏水介质上培养后，观察白粉菌侵染无需染色脱色等步骤，保存了病原 菌原始形态，便于区分白粉菌发育的不同阶段，从而达到分阶段提取RNA的目的。观察发现 ttAereae0~24hpi侵染发育过程可分为未萌发（0hpi)、萌发（4hpi)、附着胞形成（6,8 hpi)和次生附着胞形成（16, 24hpi)等4个形态显著的发育阶段，提取相应阶段总RNA即 获得该状态下AAereae转录本，经定量测定显示RNA浓度及完整性符合Illumina转录组 文库要求，采用RT-PCR扩增18SrRNA基因，为进一步开展转录组测序分析和基因表达研宄 提供基础。
【附图说明】
[0014] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
[0015]图1为橡胶树白粉菌不同发育时段的形态特征示意图； 图中，A:0hpi分生孢子（200X);B:4hpi孢子萌发（200X);C:6hpi附着胞形成 (200X);D:8hpi附着胞形成（400X);E:16hpi次生附着胞形成（400X);F:24hpi次生 附着胞形成（200X)。CO:分生孢子；gt:芽管；AP:附着胞 图2为不同时段提取得到的RNA样品电泳； 图3为18S基因在不同时段的表达电泳。
【具体实施方式】
[0016] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0017] 实施例1 (1) 选取橡胶7-33-97品系嫁接苗7-10天叶龄叶片作为培养Aewae材料，采用接菌 培养12d后HO-73 24h龄新鲜分生孢子作为实验菌源。接种前24h轻摇叶片抖落老孢子， 以新生24h龄分生孢子作为接种材料，确保实验中孢子活力及侵染结构发育均一性；将 Parafilm(美国BEMIS产品）膜置于底部有湿润滤纸的保鲜盒（40cmX30cm)中，用软毛 刷将橡胶叶片上的白粉菌孢子轻刷于Parafilm膜表面，培养温度22°C，相对湿度50%~80%， 保鲜盒避光密封保存； (2) 转移至Parafilm膜表面培养后，立即加2mL预冷的Trizol(美国Invitrogen公 司)裂解液于Parafilm膜上，用涂抹棒蘸取裂解液反复涂刮接菌介质表面，待介质上的裂解 液内可见白色粉状物或出现浑浊时，用移液器收集裂解液转移到预冷的2. 0mL离心管中， 每管分装1mL，震荡混匀30s，并确保离心管中无真菌团块，20~25°C静置10min; (3) 每离心管加入250yL氯仿，剧烈振荡15s，20~25°C静置，5min后，在4 °C，12000g，离心 15min; (4) 离心后，转移上层水相到新的RNasefree2mL离心管中；加入1/3溶液体积的醋 酸钾（pH=6. 0)，颠倒混匀并4 °C，8000g，离心1min，20~25°C静置5min，得混合溶液； (5) 混合溶液加入等体积的异丙醇，充分混匀，置于-80 °C沉降RNA样品2h; (6) 经步骤（5)处理后，在4 °C，14000g，离心10min;(7)经步骤（6)处理后，小心移 去上清，加入100yLDEPC水溶解沉淀；随后参照Omega真菌RNA试剂盒(美国Omega公司） 提取方法洗脱步骤进行，加入350yLRB，250yL70%乙醇，7yL 巯基乙醇，颠倒混 匀。
[0018] (7)将总体积 700yL样品转移至RNAminicolumn管中，4 °C，10000g，30s离 心；最终100yLDEPC水洗脱RNA，即得橡胶树白粉病菌RNA;所得的RNA-80°C保存。
[0019] 实施例2 (1) 选取橡胶7-33-97品系嫁接苗7-10天叶龄叶片作为培养Aewae材料，采用接菌 培养10d后HO-73 24h龄新鲜分生孢子作为实验菌源。接种前24h轻摇叶片抖落老孢子， 以新生24h龄分生孢子作为接种材料，确保实验中孢子活力及侵染结构发育均一性；将 Parafilm(